2015, Vol. 36
2. 包头市农业科学研究所，内蒙古 包头 014060
2. Baotou Institute of Agricultural Science, Baotou 014060, China
柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama也称亚洲柑橘木虱，属半翅目Hemiptera木虱科Psyllidae，为害柑橘Citrus reticulata Blanco、枸橼Citrus medica L.、黄皮Clausena lansium(Lour)Skeels、九里香Murraya exotica(L.)Jacks等芸香科植物，是柑橘类新梢期的主要害虫，若虫排泄一种白色分泌物粘附于叶上，会引致煤烟病发生[1].柑橘木虱喜通风透光处，果园暴露、树冠稀疏为害常较重.苗圃和幼年树经常抽发嫩芽新梢，也易发生木虱为害，严重时引起新梢生长不良，畸形扭曲，甚至慢慢干枯萎缩[2].柑橘黄龙病病原菌属于变形菌门Proteobacteria，α-变形菌纲α-proteobacterial，根瘤菌目Rhizobiales，根瘤菌科Rhizobiaceae，候选的韧皮部杆菌属Candidatus Liberibac-ter[3].根据病原16S rDNA和β-操纵子基因的序列特征，以及传病媒介和病原性质，该属分为亚洲种“Candidatus Liberibacter asiaticus”、美洲种“Ca. L. americanus”和非洲种“Ca. L. africanus”[4]3种.前2种的媒介昆虫主要为柑橘木虱[5]，非洲种由非洲柑橘木虱Trioza erytreae Del Guercio传播[6].在我国发生的黄龙病为亚洲种.由于该病原菌属于难纯培养细菌[7]，其营养需求、胞壁成分和基因组成等方面的资讯甚为缺乏，造成分类研究上的困难.
尽管云南发现为害柑橘的柚喀木虱Cacopsylla citrisuga(Yang & Li)也携带和传播黄龙病菌[8-11]，柑橘木虱仍然为我国柑橘黄龙病主要的媒介昆虫.柑橘木虱获取黄龙病菌的时间很短，在病树韧皮部取食1 h就能检测出病原的存在[12].带菌成虫在柑橘苗上取食5 h以上会传病[13].获菌饲育成虫和从带毒若虫羽化的成虫均能在短时间内获菌传病，说明木虱成虫在田间自然传播黄龙病病原的效率相当高[14].柑橘木虱具有趋嫩性，无嫩梢时则在成熟叶片或老叶的叶背取食.本文比较了柑橘木虱取食感染黄龙病柑橘植株的嫩梢、成熟叶片和老叶后的获菌效率，以期为黄龙病防治提供参考.
1 材料与方法 1.1 试验材料及仪器华南农业大学校园的九里香Murraya exotica (L.) Jacks上采集柑橘木虱成虫，转饲到网室内栽培的健康九里香上繁殖多代.
从华南农业大学黄龙病研究室繁育的沙糖橘Citrus reticulata Blanco. cv. Shatangju黄龙病盆栽苗上采集病芽，嫁接到健康酸橘上使其感染黄龙病.1年后将沙糖橘病芽摘除，表现典型黄龙病症状的酸橘通过Nested-PCR检测呈黄龙病亚洲种阳性.
血液/组织/细胞基因组DNA提取试剂盒、蛋白酶K(广州天根生物工程有限公司)；rTaq、dNTPs、10×Buffer、DL2000 DNA Marker(Takara公司)；绿如蓝核酸染料(广州蓝泽生物科技有限公司).PCR引物由上海英捷生物技术公司合成; RTC-0200 DNA Engine Cycles(Bio-RAD公司)、PAC 300型恒压恒流电泳仪(Bio-RAD公司)、LabworksTM凝胶成像系统(UVP公司).
1.2 试验方法 1.2.1 柑橘木虱的饲菌方法每个品种分别选用3株带有嫩梢、成熟叶、老叶且发病程度和长势一致的病苗进行饲菌试验.其中最顶端叶片未完全展开的为嫩梢，嫩梢下一级枝梢上为成熟叶，成熟梢下一级枝条上为老叶.每个植株成熟叶和老叶均带有典型的黄龙病斑驳黄化症状.1株苗为1个重复.在每1株黄龙病植株的嫩梢、成熟叶、老叶3个部位上，分别用1个透明带封口的塑料袋套袋后接10头健康的柑橘木虱成虫，每株共接30头，让柑橘木虱在各个部位上取食24 h后取下，单头提取DNA，通过PCR分别检测木虱的获菌效率.塑料袋使用前用针扎适当数量的小孔以利于透气.
1.2.2 柑橘木虱DNA的提取及Nested-PCR检测用天根试剂盒提取单头柑橘木虱的DNA(方法参照天根试剂盒说明书).
获得的单头木虱DNA采用Nested-PCR法检测黄龙病亚洲种病菌.使用未经饲毒木虱的DNA做为阴性对照组模板.第1轮扩增采用的引物[15]为27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′和1500R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGC-3′；第2轮采用黄龙病亚洲种病菌特异引物[16]OI1：5′-GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3′和OI2c：5′-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3′.扩增体系与反应条件同Cen等[11].扩增后电泳检测.
1.3 数据分析试验数据采用SPSS19.0进行统计分析.
2 结果与分析 2.1 柑橘木虱取食马水橘病苗的获菌效率柑橘木虱在马水橘病苗的嫩梢、成熟叶和老叶3个部位取食24 h后，单头提取DNA并进行PCR检测, 结果表明，取食成熟叶片的木虱获菌率最高，平均为66.67%，嫩梢次之，平均为33.33%，老叶部位的获菌效率最低，平均仅为10.00%.病树3个部位饲菌后柑橘木虱平均获菌率相互之间差异显著(P＜0.05)，表明吸食部位与获菌效率有关(表 1).
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表 1 柑橘木虱取食黄龙病酸橘与马水橘的不同部位获菌效率比较1) Table 1 Comparisons of bacterium acquisition efficiency of Asian citrus psyllid feeding on different parts of huanglongbing-infected Citrus reticulata and Citrus sunki |
木虱取食酸橘病苗的嫩梢、成熟叶和老叶3个部位的获菌效率比较结果表明，取食老叶获菌率最高，平均为60.00%，成熟叶片次之，平均为43.33%，嫩梢部位的获菌效率最低，平均仅为6.67%.取食老叶和成熟叶片的获菌效率差异不显著(P＞0.05)，但两者都显著高于嫩梢(P＜0.05)，表明吸食部位与获菌率相关(表 1).
2.3 柑橘木虱取食马水橘、酸橘病苗获菌效率的比较柑橘木虱在马水橘病苗上的获菌效率由高到低的顺序为：成熟叶片＞嫩梢＞老叶，而在酸橘上为：老叶＞成熟叶片＞嫩梢.说明饲菌部位与获菌效率有关，但在2个品种上的结果不一致.2个品种在相同部位的比较结果，在马水橘嫩梢上的获菌效率显著高于酸橘，而在马水橘老叶上的获菌效率则显著低于酸橘(表 1).在2个品种成熟叶片上的差异不显著，在全部3个部位上取食后平均每株获菌率差异也不显著，均为36.67%.2个品种不同部位饲菌结果的差异可能与病原在不同部位的浓度以及木虱对该部位的取食行为有关.
3 讨论与结论柑橘黄龙病病原菌是一种韧皮部杆菌属革兰氏阴性菌，在韧皮部内分布不均匀，同一株树各枝各梢发病症状、时间呈现也不同[17].本试验结果证明了柑橘木虱吸食病树的老叶、成熟叶、嫩梢其获菌率有显著差异，说明吸食部位与获菌效率密切相关.
但是吸食部位与获菌效率在马水橘、酸橘这2个品种上的表现不一致.吸食马水橘3个部位的获菌效率由高到低的顺序为：成熟叶＞嫩梢＞老叶，而酸橘为：老叶＞成熟叶＞嫩梢.这种差异可能与病原在2个品种各个部位的浓度差异有关.Li等[18]的研究结果表明，黄龙病病原菌的浓度在不同染病柑橘品种上、同一品种不同植株、同一染病植株的不同部位上差异很大，在自然染病的植株地上部分组织(包括叶中脉、叶片和树皮)中每1 g样本平均有1010个病菌基因组，部分取自相同植株的根部样本中也检测到相似的病原浓度水平，其中植株中下部的叶片病原浓度高于顶部嫩叶.Kunta等[19]比较了德克萨斯州感染黄龙病的葡萄柚Citrus paradisi Macf和甜橙Citrus sinensis(L.)Osbeck果柄、果轴、种子、叶片中脉、叶片(除去中脉)、叶边缘、嫩叶、嫩梢、花蕾、花、树干的病原浓度，发现果柄、果轴、叶片中脉上的浓度显著高于其他部位，嫩梢上的浓度最低.这2个研究结果均显示成熟的叶片比嫩梢或嫩叶病原浓度高，与本试验结果中取食成熟叶片的获菌效率高于嫩梢相吻合.
柑橘木虱吸食黄龙病马水橘老叶的获菌效率则显著低于嫩梢和成熟叶片，而吸食酸橘老叶获菌率则显著高于嫩梢，除了可能与病原在2个品种的分布不同有关之外，还可能与两者老叶的成熟度、木虱的趋性、叶片的营养和吸食时间有关.木虱具有趋嫩性，在有嫩梢的条件下一般不选择老叶取食，尽管本试验中2个品种各部位的饲毒时间均为24 h，但在此期间木虱在各部位的取食时间可能不同.杨成良等[20]用刺吸电位图谱技术测定了柑橘木虱在健康柑橘上吸食嫩叶的过程，在记录的8 h中木虱口针有74%的时间均在韧皮部吸食，但是如果在感染黄龙病的柑橘上取食，木虱口针的路径波和分泌唾液波时间会显著延长，而在韧皮部的吸食时间显著减少[21]，说明柑橘感染黄龙病后增加了木虱取食的障碍.2个品种老叶上获菌效率的差异有待于进一步用EPG进行验证.
柑橘木虱取食马水橘、酸橘病苗的嫩梢和老叶2个部位时，2个品种之间获菌效率差异达到显著水平，在成熟叶片之间的获菌效率则比较稳定，2个品种之间差异不显著，但均显著高于嫩梢.因此，在柑橘上取样检测黄龙病时建议采集成熟叶片.
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