冬瓜Benincasa hispida Cogn.为葫芦科草本植物，喜温耐热，产量高，耐贮运，是夏秋季重要蔬菜品种之一，仅广东、广西冬瓜年种植面积可达4万hm^2[1]，然而近年来冬瓜枯萎病危害严重，一般发病率为20%~30%，严重的高达50%~80%，成为毁灭性灾害^[2].有关黄瓜、甜瓜、西瓜等瓜类枯萎病的研究早在20世纪70年代已有报道^[3-4]，1985年Gertagh等^[5]报道导致冬瓜枯萎病的病原物是一种新的专化型——冬瓜枯萎病菌专化型Fusarium oxysporum Schl. f. sp. benincasae.此后，谢双大等^[6]、曾华兰等^[7]和孙妍芳等^[2]均对冬瓜枯萎病菌的遗传特性及生物学特性进行了研究.帅正彬^[8]和陈云呈^[9]研究了防治枯萎病的方法，如农业防治上，选用抗病良种、轮作、嫁接换根等；化学防治如种子消毒、培养无病瓜苗等.生物防治具有无污染、不杀伤天敌、不会(或较少)产生抗药性、有利于人畜安全及环境保护、兼防兼治，且符合有机农业的发展要求，备受人们重视^[10].目前生物方法防治枯萎病在很多瓜类上均有研究，如黄瓜^[11]、甜瓜^[12]、苦瓜^[13]等，但冬瓜枯萎病的生物防治在国内鲜见报道.

生物有机肥是指将具有特定功能的微生物与腐熟的有机肥复合而成的一类兼具微生物肥料和有机肥效果的新型肥料.既有利于增产、改善农产品品质^[14]，又可培肥土壤、调节土壤微生物结构^[15]、提高土壤酶活性^[16-17]，从而改善作物根际土壤微生态环境，增强抗病力.本文通过盆栽试验研究生物有机肥对冬瓜枯萎病的防治效果，探讨施用生物有机肥对土壤微生物和土壤酶活性的影响及与防病效果的关系，为利用生物途径防治冬瓜枯萎病提供理论依据.

1 材料与方法 1.1 材料

菌种AF11b，为华南农业大学资源环境学院土壤微生物学实验室采用利福平标记的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，该菌株抗利福平质量浓度为100 μg·mL^-1[18].冬瓜枯萎病病菌F. oxysporum Schl.f. sp. benincasae，由华南农业大学植物病理系王振中教授提供.冬瓜种子由广东省农业科学院蔬菜研究所瓜类研究室提供.

有机肥:由广州市永雄生物科技有限公司提供，以米糠、豆粕、玉米粉、花生麸等高纤维有机物为原材料，添加固氮菌群、解磷细菌群和解钾细菌群等多种植物促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)，全N、全P、全K和有机质质量分数分别为41.6、7.5、16.5和678.5 g·kg^-1，pH5.13.生物有机肥：将有机肥与菌种按100:1(100 g有机肥：1 mL菌液)混合而成，功能菌(AF11b)4.2×10⁹ cfu·mL^-1.

供试土壤：由赤红壤发育而成的水稻土，采自华南农业大学农场.土壤pH 6.16，有机质为29.3 g·kg^-1，碱解氮(N)为92.40 mg·kg^-1，有效磷(P)为50.02 mg·kg^-1，速效钾(K)为179.53 mg·kg^-1.

1.2 试验设计

试验于2013年3月20日—5月24日在华南农业大学塑料网室内进行.共设置6个处理：1)不施肥，不加病原菌(CK)；2)不施肥，加病原菌(CPC)；3)施有机肥，加病原菌，1 kg土施N 0.2 g(OF)；4)施低量生物有机肥，加病原菌，1 kg土施N 0.1 g(BOF1)；5)施中量生物有机肥，加病原菌，1 kg土施N 0.2 g，与OF处理等养分量(BOF2)；6)施高量生物有机肥，加病原菌，1 kg土施N 0.3 g，肥料均作基肥一次与土壤混均施入(BOF3).种植60 d后收获，每盆种植1株冬瓜，每个处理15盆，共3个重复.不同处理的其他管理措施一致.

将完全长出2片子叶的冬瓜幼苗移栽到试验盆中，待其长出4~5片真叶，除CK处理外，其他处理均采用伤根法接入病原菌，接种量约5×10⁶ mL^-1[19].

1.3 测定项目及方法 1.3.1 病情调查

从各处理出现发病情况起，每隔10 d调查1次，共调查5次.冬瓜枯萎病按发病严重程度分为5级^[7]：0级健株，无症状；1级病株25%以下叶片发病；2级病株26%~50%叶片表现症状；3级病株51%~90%叶片表现症状；4级病株几乎所有叶片表现症状，植株枯死或急性凋萎死亡.

病情指数=[∑(病级株数×代表数值)/(株数总和×发病最重级的代表数值)]×100，

防病效果=[(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数]×100%.

1.3.2 生物量调查

移栽第60天收获，分别测定株高、茎粗、叶宽和鲜质量.株高用卷尺测量从地面至主茎顶端生长点的高度；主茎直径采用游标卡尺测定距离茎基部2 cm处的直径；叶宽统一测定倒数第5片叶；鲜质量用百分之一天平称量^[20].

1.3.3 土壤微生物数量测定

采用稀释涂平板法测定土壤中细菌、真菌、放线菌、尖孢镰刀菌数量.细菌培养用牛肉膏蛋白胨培养基，放线菌培养用高氏1号培养基，真菌培养用孟加拉红培养基，尖孢镰刀菌培养用尖孢镰刀菌选择性培养基^[21].冬瓜苗移栽时(0 d)取根际土样1次，生长期间每隔20 d取土样1次，共取4次根际鲜土样.尖孢镰刀菌数量从幼苗长出4~5片叶接入病原菌后开始测定，每隔20 d取土样1次，共取3次根际鲜土样.

1.3.4 土壤酶活性测定

脲酶活性测定采用靛酚蓝比色法，酸性磷酸酶活性测定采用氯代二溴对苯醌亚胺比色法，蔗糖酶活性测定采用3, 5-二硝基水杨酸(DNS)比色法，过氧化氢酶活性测定采用高锰酸钾滴定法^[22].

1.4 统计方法

利用SAS 9.0软件对数据进行统计分析，采用Duncan’s法对数据进行差异显著分析，图表用Excel 2007进行制作.

2 结果与分析 2.1 生物有机肥对冬瓜枯萎病的防治效果

CPC处理发病时，幼苗顶端有失水现象.在接入病原菌后第14天(即移栽20 d)开始发病，至第60天，CPC处理的病情指数一直保持最高；生物有机肥施用量越高，病情指数越低，防病效果越好，说明施用生物有机肥对冬瓜枯萎病的防治具有显著效果.各处理病情指数随着冬瓜的生长都在上升，第60天调查时，CPC处理病情指数达到55.36(图 1A).将CPC处理防效指定为0，OF处理防效为31.91%，BOF1、BOF2和BOF3处理防效分别为42.27%、57.92%和70.15%(图 1B).在等养分量条件下，BOF2处理的病情指数比OF处理下降了26.01%，说明生物有机肥的防病能力显著高于有机肥.

2.2 生物有机肥对冬瓜生物量的影响

从表 1可以看出，移栽第60天时，CK处理在株高、茎粗、叶宽、鲜质量方面均高于CPC处理，说明枯萎病的发生影响了冬瓜的生长.OF处理和3个BOF处理的各项生物量指标均高于CPC处理，说明有机肥和生物有机肥均有促生作用，在养分条件相同的条件下，BOF2处理的株高、茎粗、叶宽和鲜质量比OF处理分别高17.12%、10.15%、13.32%和8.03%，说明生物有机肥在促进冬瓜生长方面比有机肥更加显著；生物有机肥处理施肥量越高，促生效果越好.

2.3 生物有机肥对土壤中主要微生物菌群数量的影响 2.3.1 尖孢镰刀菌数量

从图 2A可以看出，经过3次采样检测，生物有机肥处理都不同程度地降低了尖孢镰刀菌的数量.在有效养分相同的情况下，第40天和第60天检测时，BOF2处理土壤中尖孢镰刀菌数量显著低于OF处理，说明生物有机肥中的功能菌可以有效抑制土壤中尖孢镰刀菌的增长，降低感病概率，且各生物有机肥处理土壤中尖孢镰刀菌的数量随着施肥量的增加而减少.

2.3.2 细菌数量

从图 2B可以看出，OF处理和3个生物有机肥处理的土壤中细菌含量均高于CK处理和CPC处理，并随着移栽天数的增加呈上升趋势，说明有机肥和生物有机肥都能够促进细菌的繁殖，在有效养分相同的情况下，BOF2处理土壤中细菌含量显著高于OF处理，说明生物有机肥比有机肥能更有效地增加土壤中细菌的数量.

2.3.3 真菌数量

从图 2C可以看出，CPC处理土壤中真菌含量呈上升趋势，3个不同用量生物肥处理在第40天时，土壤中真菌含量达到最高，随后逐渐减少，在第60天测定时，OF处理真菌含量高于BOF2处理，但差异不显著.

2.3.4 放线菌数量

从图 2D可以看出，3个生物有机肥处理在移栽后第20—60天采样测定的土壤中放线菌含量均高于其他处理，CPC处理随着移栽天数的增加土壤中放线菌含量逐渐下降，说明生物有机肥可以促进放线菌的繁殖；BOF1处理和OF处理4次测定结果差异不显著，但生物有机肥施肥量越大，放线菌含量越高.

2.3.5 土壤中主要微生物菌群数量与病情指数的相关分析

统计各处理的病情指数，并结合4次采样所测得的土壤主要微生物菌群数量进行相关性分析，结果(表 2)表明，尖孢镰刀菌与病情指数、真菌呈极显著的正相关，真菌与病情指数呈显著正相关，说明土壤中尖孢镰刀菌的存在是引起冬瓜枯萎病的主要因素，并且土壤中真菌含量的增多会增加病害的发生.土壤中放线菌与病情指数呈极显著负相关，细菌与病情指数呈负相关，但并不显著，细菌与放线菌数量均与土壤中尖孢镰刀菌的数量呈极显著负相关性，说明土壤中细菌和放线菌数量的增加有利于降低病害的发生.

2.4 生物有机肥对土壤酶活性的影响 2.4.1 脲酶活性

土壤中脲酶是唯一对尿素的转化具有重大影响的酶^[23].土壤中存在着能生成脲酶的微生物，在土壤中添加能促进微生物活动的有机物质能使土壤中的脲酶活性增强^[24].由表 3可见，在冬瓜整个生长期内不同施肥处理脲酶活性变化相似，呈现先降低后上升的趋势，第60天时CPC处理比CK处理的脲酶活性稍低，说明病原菌会影响土壤脲酶的活性.3个不同用量生物肥处理在第1次采样时脲酶活性高于其他3个处理，这可能是由于生物有机肥的施用刺激了土壤中脲酶的活性.在第20天，各处理的脲酶活性降低可能与植株发病有关，至第60天，3个不同用量生物肥处理和OF处理脲酶活性均高于CK和CPC处理，说明施用生物有机肥和有机肥均可以提高土壤中脲酶活性，生物有机肥在提高土壤脲酶活性方面的作用较有机肥更明显，且随着生物有机肥用量的增加而提高.

2.4.2 酸性磷酸酶活性

磷酸酶主要来源于植物根系和土壤微生物的分泌物，对土壤中有机磷的水解有重要贡献，其活性的高低甚至可以用作诊断植株磷素丰缺的指标^[25].由表 4可见，CPC处理在第40天后的酸性磷酸酶活性可能由于发病严重的原因持续下降；3个不同用量生物肥处理的变化趋势相似，在第40天土壤酸性磷酸酶的活性下降到最低，至第60天，3个不同用量生物肥处理酸性磷酸酶的活性差异不显著，OF处理的酸性磷酸酶活性比3个不同用量生物肥处理低，说明生物有机肥中的功能菌能够在抵抗植株发病的情况下提高土壤中酸性磷酸酶活性.

2.4.3 过氧化氢酶活性

过氧化氢酶可促进土壤中多种化合物的氧化，防止过氧化氢酶积累对生物体造成毒害.过氧化氢酶活性与好氧微生物数量、土壤肥力密切相关，它可以表示土壤氧化过程的强度^[26].由表 5可见，不同施肥处理对土壤过氧化氢酶活性的影响总体呈上升趋势，其中BOF1处理的过氧化氢酶活性一直高于其他处理.所有处理在后期过氧化氢酶活性无显著差异，说明生物有机肥和有机肥对过氧化氢酶的活性影响较小.

2.4.4 蔗糖酶活性

蔗糖酶可使不能直接被植物吸收的蔗糖分解成葡萄糖和果糖，活性大小可以间接表征土壤中有机碳的转化情况^[27]，也可以作为评价土壤熟化程度和土壤肥力水平的一个指标^[22].由表 6可见，移载后40~60 d, 3个不同用量生物肥处理和OF处理的土壤蔗糖酶活性均高于CK和CPC处理，其中土壤蔗糖酶活性随着生物有机肥施用量的增加而提高，至第60天，OF处理和3个不同用量生物肥处理的土壤蔗糖酶活性比CPC处理分别高68.58%、61.95%、86.29%和96.59%.说明生物有机肥和有机肥均能提高土壤中蔗糖酶的活性，且生物有机肥的施用量越高，效果越明显.

3 讨论和结论

本研究结果表明，施用生物有机肥可以有效防治冬瓜枯萎病，生物有机肥的施用量越高，其防治效果越好，这与任爽等^[13]对苦瓜枯萎病及高雪莲等^[12]对甜瓜枯萎病的研究结果一致.BOF3的防效达到70.15%，比BOF1和BOF2分别提高了27.88%和12.20%，这可能与生物有机肥中拮抗菌能在植物根表或根内定殖有关^[18], 也可能是由于拮抗菌直接的抑菌作用^[28].生物有机肥的施用对冬瓜的生长有明显的促生效果，使冬瓜的抗病性增强.

与单接病原菌处理比较，生物有机肥的施入显著提高了土壤中细菌和放线菌的数量，降低了真菌的数量, 显著降低了土壤中尖孢镰刀菌的数量，这与以往的研究结果一致^{[10, 12-13]}.生物有机肥调节和改善了土壤中微生物菌落结构，从而起到防病、抑病的作用.这与生物有机肥中的功能菌能够有效抑制尖孢镰刀菌和真菌的生长有关.

土壤酶在生态系统的有机质分解和养分循环所必须的催化反应中起重要作用^[29].已有研究表明，土壤酶与土壤肥力直接相关^{[17, 30-31]}，还有人建议将土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶、过氧化氢酶4种酶作为评价土壤肥力的指标^[24].本研究结果表明，施用生物有机肥能够提高上述这4种酶的活性，但并没有因为生物有机肥施用量的变化而表现出一定的规律性，这与任爽等^[13]的研究结果一致, 即随着施肥量的增加，酶的活性也逐渐增强且存在差异.施用生物有机肥以后，土壤中4种土壤酶活性均高于其他处理，可能是生物有机肥提高了土壤中微生物的多样性，有益于微生物繁殖，使土壤微生物的代谢更加旺盛，从而提高了土壤酶的活性.

施用生物有机肥可显著提高土壤中细菌和放线菌的数量，提高土壤酶的活性，降低真菌的数量和土壤中尖孢镰刀菌的数量，促进冬瓜生长，显著降低了冬瓜枯萎病的发病率.研究结果可为利用生物有机肥防治冬瓜枯萎病提供参考.