2015, Vol. 36
2. 云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201;
3. 微生物菌种筛选与应用国家地方联合工程研究中心，云南 昆明 650217;
4. 玉溪市农业科学院，云南 玉溪 653100
2. Faculty of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;
3. National and Local Joint Engineering Research Center for Screening and Application of Microbial Strains, Kunming 650217, China;
4. Yuxi Academy of Agricultural Sciences, Yuxi 653100, China
磷是植物生长和生殖必需的营养元素之一，同时还能促进光合作用和碳水化合物的合成与运转，促进氮素、脂肪和核酸代谢，提高作物对环境的适应性[1].我国土壤中的总磷量相当可观，但95%以上的磷以稳定的铝硅酸盐和磷灰石等无效形式存在，难以被植物直接利用[2].磷肥在作物生长的当季利用率不到25% [3]，磷肥的大量施用造成磷素在土壤中的不断积累，容易引起土壤板结以及水体富营养化等环境问题.据估算，1949—1992年间，我国累计施入农田的磷肥达3.4 × 107 t，其中大约有2.6 × 107 t磷累积在土壤中[4].因此，如何减少土壤的磷素积累，提高其利用率已成为当今的研究热点.
土壤中存在多种溶磷微生物，它们能通过自身代谢促进磷矿粉等难溶磷的溶解，使之转化为可被植物直接吸收利用的有效磷.合理利用溶磷微生物能降低磷肥的投入成本，亦可作为一项提高作物产量的重要措施[5-6].本研究以采自磷矿区植物的根围土壤为研究对象，分离、筛选出溶磷细菌，通过脂肪酸鉴定和16S rDNA部分测序鉴定出溶磷细菌的种属，研究高效菌株的溶磷效果，运用单因素筛选和正交试验[7]摸索溶磷的优化条件，为溶磷菌菌剂的开发利用提供试验依据.
1 材料与方法 1.1 样品和培养基土壤样品采自云南玉溪磷矿区附近长势良好的玉米Zea mays、臭灵丹Laggera pterodonta，艾蒿Artemisia argyi、芒草Miscanthus、绿豆Vigna radiate等植物的根围.土样采集后贮存于透明封口袋内并编号，置于4 ℃冰箱中，保存备用.
分离筛选培养基：C6H12O6 10 g，Ca3(PO4)2 5 g，(NH4)2SO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KCl 0.2 g，酵母浸膏0.5 g，MnSO4·4H2O 0.002 g，FeSO4·7H2O 0.002 g，40 g·L-1溴酚蓝(pH 6 ~ 7)6 mL，琼脂18 g，蒸馏水1 L，pH 7.0 ~ 7.2.
磷矿粉液体培养基：C6H12O6 10 g，磷矿粉10 g [w(磷)为22%]，(NH4)2SO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KCl 0.2 g，酵母浸膏0.5 g，MnSO4·4H2O 0.002 g，FeSO4·7H2O 0.002 g，蒸馏水1 L，pH 7.0 ~ 7.2.
1.2 溶磷菌筛选稀释平板培养法分离、筛选溶磷菌.称取10 g土样加入盛有90 mL无菌水的250 mL锥形瓶中，28 ℃，120 r·min-115 min，制成10-1浓度溶液，然后按10倍稀释法依次制备10-2、10-3、10-4、10-5浓度土壤悬液.取10-3、10-4及10-5的土壤稀释悬液各0.1 mL均匀涂布于分离筛选培养基平板上，每个浓度重复3次.倒置平板于30 ℃培养箱中培养24 ~ 48 h，观察并测量菌落直径和溶磷圈直径，计算溶磷圈与菌落直径比.
选择溶磷圈与菌落直径比较大的菌株，接种于磷矿粉液体培养基中，30 ℃、200 r·min-1培养7 d后，测定培养液中水溶性磷含量.选择培养液中有效磷浓度最高的1个菌株开展后续的溶磷条件优化试验.
1.3 溶磷圈及水溶性磷含量测定用灭菌的牙签将菌株分别点接在以Ca3(PO4)2为唯一磷源的培养基上，30 ℃培养5 ~ 7 d，测量溶磷圈直径(D)和菌落直径(d).
挑取单个菌落分别接入以磷矿粉为唯一磷源的液体培养基中，30 ℃、150 r· min-1培养7 d后，12 000 r·min-1、15 min，取上清液用钼蓝法测定含磷量，根据标准曲线计算出上清液中水溶性磷的含量.
1.4 溶磷细菌的鉴定全细胞脂肪酸分析和16S rDNA测序相结合来鉴定菌株.全细胞脂肪酸分析采用Sherlock全自动细菌鉴定系统，参照说明书进行操作和鉴定.细菌DNA提取采用冻融法[8].16S rDNA基因片段的PCR扩增采用细菌通用引物P0(5'-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3')和P6(5'- CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3').PCR扩增采用20μL反应体系：10 × EasyTaq Buffer(含Mg2+)2.0μL，dNTPs(10 mmol·L-1)1.6μL，P0(10 mmol·μL-1)和P6(10 mmol·μL-1)均为1.0 μL，EasyTaq DNA Polymerase(5 U·μL-1，Transgene)0.2 μL，模板DNA(10 ~ 50 ng·μL-1)0.5 μL，补充ddH2O至20 μL.PCR反应程序为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环，最后72 ℃延伸10 min.PCR产物经0.8 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳，试剂盒回收目标条带，将回收后的16S rDNA片段连接到pMD18-T载体上，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，菌落PCR验证阳性克隆[9].确认的克隆由北京华大基因公司测序，测序结果与NCBI分子生物学数据库比对序列相似性.
1.5 正交试验数据统计分析用软件正交设计助手ⅡⅤ3.1专业版进行处理分析.在做正交设计时，主要考虑磷矿粉量、温度、摇床转速、发酵时间对溶磷能力的影响，采用4因子3水平[L9(34)]正交试验，重复3次，试验设计见表 1.
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表 1 正交试验设计 Table 1 The design of orthogonal test |
对试验中的数据采用SAS v6.12进行统计分析和Duncan's多重比较.
2 结果与分析 2.1 溶磷细菌的筛选本次试验共筛选出22株具有较明显溶磷圈的菌株，选取溶磷圈直径(D)与菌落直径(d)比值(D/d)比较大的12株菌株，摇瓶复筛，结果见表 2.其中YN2014101和YN2014102的溶磷效果最好.菌株YN2014102在分离筛选培养基平板上，在28 ℃下培养2 d，菌落中等大小、不透明、凸起，黄色，被选作进一步研究的菌株.
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表 2 溶磷细菌从磷矿石中释放出的水溶性磷含量 Table 2 Available phosphorus dissolved by the bacterial strains from phosphate rocks |
以脂肪酸种类和含量为参数，与标准数据库比对，有3个菌株与新分离到的菌株YN2014102相似程度较高，其中与Burkholderia cenocepacia的相似系数最高，达0.902，与B. cenocepacia-GC subgroup B(Pseudomonas cepacia)的相似系数为0.639，与B. andropogonis的相似系数0.630.依据相似系数大小，菌株YN2014102可能属于B. cenocepacia.
2.3 16S rDNA序列分析根据16S rDNA的测序与NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)BLAST比对的结果，与菌株YN2014102序列相似性较高的菌株均属于伯克霍尔德菌属，且与洋葱伯克霍尔德菌B. cenocepacia相似性达99%.即菌株YN2014102的16S rDNA序列比对与脂肪酸测定结果一致，故菌株暂鉴定为洋葱伯克霍尔德菌.
2.4 各因素对水溶性磷含量的影响由图 1可知，水溶性磷含量随着磷矿粉含量的增加而减少，当磷矿粉质量浓度为10 g·L-1时，可能刚好与菌体均匀悬浮，达最佳状态，所以溶磷的效果最好，故确定最佳磷矿粉质量浓度为10 g·L-1；随着时间的延长，水溶性磷含量上升后递减，所以确定最佳发酵时间为5 d；随着温度升高，水溶性磷含量先增后减，28 ℃之后增量并不是太显著，故确定最佳的发酵温度28 ℃；转速也是发酵过程中较重要的参数，改变转速会改变供氧条件，最佳转速使菌体处于最佳溶解氧状态，并使菌体处于均匀悬浮状态，由图 1可以看出水溶性磷含量随摇床转速的增加而略有增加，且180 r·min-1之后渐趋于平缓，所以最佳摇床转速为180 r·min-1.
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图 1 各因素对水溶性磷含量的影响 Figure 1 Effects of different fators on the contents of available phosphorus |
为了优化溶磷的培养条件，根据以上单因素试验结果，设计了表 1中的4因素3水平正交试验，所得到结果如表 3.在9个处理中，A2B1C2D2的溶磷效果最好，极显著地高于其他处理，即磷矿粉质量浓度10 g·L-1，28 ℃，180 r·min-1培养5 d，菌株YN2014102在培养基中的水溶性磷达277.08 mg·L-1.以A3B3C2D1效果最差，磷矿粉10 g·L-1处理水溶性磷含量极显著地高于50 g·L-1和100 g·L-1处理的，这可能是培养基中固相物多影响了菌株YN2014102的培养。5 d后可溶性磷含量较高，这可能与培养周期长，培养基中其他营养已消耗，培养周期短，菌株YN2014102生长量不够有关.
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表 3 正交试验结果 Table 3 The orthogonal test results |
利用显著性差异和极差分析了各因素对水溶性磷含量的影响(表 4).从表 4可知，所选的时间，温度，磷矿粉含量，摇床转速对水溶磷的含量的影响存在显著性差异，说明这几个因素确实影响了该菌的溶磷能力.极差反映了该因素变化时对试验指标的影响，极差越大，该因素对试验的影响越显著.从总体来看，磷矿粉量的多少对培养基中YN2014102的溶磷量影响最大，其次是培养时间，温度和摇床转速.
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表 4 正交试验分析1) Table 4 Range analysis of the orthogonal test results |
具有溶磷能力的微生物有很多，目前已报道的溶磷菌主要包括芽孢杆菌属Bacillus、假单胞菌属Pseudomonas、欧文氏菌属Erwinia、土壤杆菌属Agrobacterium、沙雷氏菌属Serratia、黄杆菌属Flavobacterium、硫杆菌属Thiobacillus、色杆菌属Chromobacterium、产碱菌属Alcaligenes、节杆菌属Arthrobacter、沙门氏菌属Salmonella、肠杆菌属Enterbacter、微球菌属Micrococcus、固氮菌属Azotobacter和根瘤菌属Bradyrhizobium等[10].有关洋葱伯克霍尔德氏菌溶磷、抑菌及促生长已有报道[11-15]，但鲜见云南磷矿区土壤分离得到的洋葱伯克霍尔德氏菌的报道.
有关溶磷培养条件的优化也早有研究，大多从C源、N源、NaCl、pH、装液量、接种量、种龄、温度、摇床转速等方面来进行研究[16-18].溶磷过程是复杂的，并不是某一因素起全部作用，而是多种因素共同作用的结果，溶磷培养条件也会因菌株的不同而异.本试验对磷矿粉含量、培养时间、温度和摇床转速这4个因素进行洋葱伯克霍尔德菌YN2014102溶磷条件的优化，进一步证实了其具有很强的溶磷活性，明确了其溶磷活性与上述提及的4个因素紧密相关.通过正交试验，证明以磷矿粉10 g·L-1为唯一磷源，在28 ℃、180 r·min-1的条件下发酵5 d，发酵液中的水溶性磷质量浓度达到277.08 mg·L-1.然而，这种优化条件还只是试验性的，要真正运用菌株YN2014102溶磷，实现低品位磷矿石无害化应用及提高田间磷使用效率，还需深入研究.
洋葱伯克霍尔德氏菌不是一个简单种，而是一组表型相近但基因型不同的复合物，至今已发现它包括17个不同的基因型，由于这些基因型之间有很低的DNA杂交率，因此不同基因型可代表不同的种[19-21].有些种具有生物防治、促进植物生长、生物修复等功能，有些种是人类的条件致病菌，能引起肺囊性纤维化，或引起医院病人临床感染[22].因此，本研究中的菌株YN2014102究竟属于哪一个种？是否引起人类疾病，还有待下一步试验证实.
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