2015, Vol. 36
2. 华南农业大学 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广东 广州 510642
2. State Key Lab for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
据世界卫生组织调查，全球78个国家确认存在维生素A缺乏的公共健康问题，约1/4的儿童和孕妇(2.5亿)存在维生素A缺乏症，每年超过25万儿童因维生素A缺乏失明，近半在1年内死亡(http://www.harvestplus.org/vita.html).中国属中度亚临床维生素A缺乏，贫困地区儿童的维生素A缺乏较为严重，人体不能合成维生素A，需从食物中摄取，植物性维生素A源占70%，是人类的主要维生素A源[1-2].提高植物性食物中维生素A源是解决贫困人口维生素A缺乏的重要途径.
玉米是富含维生素A源的主要粮食作物之一，其籽粒包含5种主要的类胡萝卜素：α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、β-隐黄质、叶黄素和玉米黄质，非维生素A源的叶黄素和玉米黄质是其类胡萝卜素的主要成分[3-5].玉米富含能量，是赞比亚、南非、墨西哥等地区主要粮食来源，人均年消费量在100 kg以上，提供了人体所需的能量及蛋白质的30% ~ 60% [6].生物强化是通过育种提高主要粮食作物的微量营养物质含量，是有效和可持续解决长期微量营养不良的有效方法之一，从经济的角度来看，生物强化更适合于农村或偏远地区、其他方法如药物补充等方法不可能完全覆盖的地方[7].丰收计划项目根据人体日常摄入维生素A的基本量(成人400 g·d-1、儿童200 g·d-1)将玉米的维生素A源生物强化指标设定为15 μg·g-1 [8].而维生素A源强化育种面临的最大问题是高昂的检测费用.
利用类胡萝卜素合成突变体及类胡萝卜素生物合成阻断的抑制剂，逐渐阐明了类胡萝卜素的生物合成代谢途径[9].其中PSY、LCYE和HYD基因是重要的合成限速基因.PSY基因编码八氢蕃茄红素合酶，是类胡萝卜素合成的第一步.Fu等[10]克隆了玉米、大刍草、摩擦禾、薏苡和高粱5个物种和4个水稻品种的PSY基因，并用2个自然群体对其进行了关联分析.Harjes等[9]采用关联分析等方法对玉米类胡萝卜素合成途径中的关键基因LCYE进行了克隆，检测到4个等位基因变异，可解释58%的(α-胡萝卜素+叶黄素)/(β-胡萝卜素+β-隐黄质+玉米黄质)表型变异.Yan等[11]用3个关联分析群体克隆了HYD基因并更名为CrtRB1，检测到3个等位基因变异，分别命名为5′TE、InDel4和3′TE，5′TE可解释32%的β-胡萝卜素表型变异，InDel4和3′TE可解释7% ~ 27%的类胡萝卜素表型变异.以上3个基因均已开发了基于PCR技术的功能标记，本研究以47份甜玉米自交系为材料，采用高效液相色谱法检测其类胡萝卜素各组分的含量，合成PSY1、LCYE和CrtRB1基因的功能标记并在47份甜玉米自交系中检测其基因型，结合基因型和类胡萝卜素各组分的含量，检测3个关键基因的单倍型效应，并分析其联合单倍型效应，以期为甜玉米的维生素A源强化育种奠定基础.
1 材料与方法 1.1 材料以华南农业大学农学院甜玉米组选育的47份甜玉米骨干系为材料，其来源多样、表型存在明显差异.普通玉米KUI3/B77的F2：3后代家系KB-7，包含PSY1、LCYE和CrtRB1有利等位基因，由中国农业大学国家玉米改良中心提供.于2009年秋季在华南农业大学增城试验基地种植，行长4.00 m、宽0.67 m，每个自交系种植2行，顺序排列，田间管理与大田管理基本相同.每个甜玉米材料通过自交授粉保持基因型稳定，于授粉后第21天每种基因型选取5个无病虫害感染的果穗风干后脱粒、混匀，同一材料取样3次，磨粉后避光保存于4 ℃冰箱.
1.2 类胡萝卜素的提取与检测样品中类胡萝卜素的提取与检测均在中国农业大学国家玉米改良中心实验室进行.类胡萝卜素的提取方法参考Egesel等[12]的方法进行.采用高压液相色谱法(HPLC)[13]分离样品类胡萝卜素各组分，基于外标法[3]构建的回归方程对样品类胡萝卜素各组分含量进行量化分析.其标样由中国农业大学国家玉米改良中心提供，液相色谱系统为日本岛津公司生产的2001Simzdu操作系统，色谱柱为反相YMC类胡萝卜素C30柱子(5 μm × 4.6 mm × 250 mm)(Waters chromatography，Milford，MA).采用等度洗脱，流速是2 mL·min-1，柱温控制在30 ℃，检测波长为450 nm.
1.3 DNA的提取及主要试剂于大喇叭口期采集各自交系幼嫩叶片，采用改良CTAB法提取叶片基因组总DNA[14]，并用紫外分光光度计测量DNA浓度和相对纯度，用1 × TE将DNA稀释至25 ng ·μL-1，于- 20 ℃冰箱中保存备用.主要试剂Taq DNA聚合酶、dNTPs、Buffer、MgCl2等购自晶美生物工程有限公司，引物由北京奥科鼎盛生物科技公司合成.
1.4 引物及PCR反应体系用于扩增甜玉米基因PSY1、LCYE和CrtRB1的引物序列信息分别来自于文献[9, 11, 15]，本研究选用PSY1基因的Indel1和Indel4、LCYE基因的5′Indel和3′Indel及CrtRB1基因的Indel4和3′TE位点进行基因的单倍型分析(表 1).
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表 1 基因PSY1、LCYE和CrtRB1单倍型分析所用引物序列 Table 1 The sequences of primers for haplotype analysis of PSY1, LCYE and CrtRB1 genes |
PCR反应在PTC-100TM PCR仪上完成，反应总体系为20 μL[13]，其中玉米材料基因组DNA 50 ~ 60 ng，10 × PCR Buffer(含Mg2+)2.00 μL，25 mmoL·L-1 dNTPs 0.20 μL，2 U·μL-1 Taq酶0.50 μL，每种引物质量浓度为30 ng·μL-1，ddH2O 12.30 μL.PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，35个循环；最后72 ℃再延伸5 min.不同的引物扩增时退火温度不同.
1.5 统计分析采用Agilent 1200色谱数据工作站记录和分析HPLC的测定结果，以1/2(β-隐黄质+ α-胡萝卜素)+ β-胡萝卜素含量为维生素A源含量，5种组分的总和为总类胡萝卜素含量；PCR扩增结果与KB-7带型位置相同带型记为1，无带记为0，用SAS8.0的GLM程序进行单倍型效应分析.
2 结果与分析 2.1 甜玉米材料的类胡萝卜素含量变异对47份甜玉米自交系乳熟期籽粒类胡萝卜素各组分的定量分析结果(表 2)表明，甜玉米中类胡萝卜素质量分数从高到低依次为叶黄素、玉米黄质、β-隐黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素，其变异范围分别为0.99 ~ 43.52、0.31 ~ 19.07、0.07 ~ 35.48、0.03 ~ 3.85和0.04 ~ 4.48 μg·g-1，均值分别为15.83、7.43、4.28、0.52和0.88 μg·g-1.总类胡萝卜素均值为28.94 μg·g-1，变异范围为1.44 ~ 75.98 μg·g-1，最高值与最低值相差52.7倍，变异系数达0.548；维生素A源均值为3.282 μg·g-1，变异范围为0.07 ~ 22.75 μg·g-1，变异系数达1.867，最高值与最低值相差307.5倍，其中A5和A37的维生素A源质量分数高于15 μg·g-1.
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表 2 47份甜玉米自交系类胡萝卜素各组分及维生素A源的含量平均值 Table 2 The average values of carotenoid components and pro-vitamin A contents in 47 sweet corn inbred lines |
在用来进行单倍型鉴定的功能标记PSY1基因的Indel1和Indel4、LCYE基因的5′Indel和3′Indel及CrtRB1基因的Indel4和3′TE中，仅CrtRB1基因的Indel4未在47份甜玉米骨干系检测出多态性，其余5个标记均可检测出多态性.基因PSY1的Indel1和Indel4与乳熟期甜玉米籽粒中玉米黄质和总类胡萝卜素含量显著相关，由Indel1和Indel4位点组成的单倍型分别可解释玉米黄质和总类胡萝卜素含量表型变异的14.81%和13.00%(表 3).
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表 3 甜玉米自交系中PSY1基因Indel1和Indel4的单倍型效应分析 Table 3 Haplotype effects of Indel1 and Indel4 for PSY1 gene in sweet corn inbred lines |
基因LCYE的5′Indel和3′Indel位点组成的单倍型效应除叶黄素含量外其余均达显著和极显著水平，分别可解释β-胡萝卜素、维生素A源和总类胡萝卜含量表型变异的15.77%、20.75%和15.92%.其中单倍型“11”的类胡萝卜素各组分及维生素A源含量均高于其他单倍型(表 4).基因CrtRB1的功能标记3′TE在类胡萝卜素各组分及总类胡萝卜素含量上均未检测出显著性(表 5).
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表 4 甜玉米自交系中LCYE基因的5′Indel和3′Indel单倍型效应分 Table 4 Haplotype effects of 5′Indel and 3′Indel for LCYE gene in sweet corn inbred lines |
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表 5 甜玉米自交系中CrtRB1基因的3′TE单倍型效应分析 Table 5 Haplotype effect of 3′TE for CrtRB1 in sweet corn inbred line |
对基因PSY1、LCYE和CrtRB1进行基因间联合单倍型分析，3个基因的5个多态性标记共检测到8种组合方式，其组成的联合单倍型效应除叶黄素含量外其余均达极显著水平，分别可解释β-胡萝卜素、维生素A源和总类胡萝卜含量表型变异的37.20%、40.71%和41.11%.其中单倍型“10110”的类胡萝卜素各组分及维生素A源含量均高于其他单倍型(表 6).与单基因效应值相比，基因间联合单倍型能够解释的各成分表型变异显著提高.对不同单倍型材料的β-胡萝卜素、维生素A源和总类胡萝卜素含量分析发现，基因间联合单倍型能解释的β-胡萝卜素含量表型变异由PSY1基因的5.16%、LCYE基因的15.77%和CrtRB1基因的2.31%提高到37.20%，维生素A源和总类胡萝卜素含量也由原来的最大值20.75%和15.92%(LCYE基因)提高到现在的40.71%和41.11%.可见PSY1、LCYE和CrtRB1基因均对甜玉米籽粒中维生素A源含量有一定的增效作用，3个基因互作时，表型的增效作用大于简单的效应累加，基因间存在上位性互作效应.
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表 6 甜玉米自交系中PSY1、LCYE和CrtRB1基因5个标记的联合单倍型效应分析1) Table 6 Joint haplotype effects of 5 functional markers for PSY1, LCYE and CrtRB1 genes in sweet corn inbred lines |
随着生活水平的提高，人们越来越关注食品的营养和健康.甜玉米是一种鲜食类型玉米，是重要的果蔬来源，其品质可分为外观品质、营养品质、食用品质等，其中营养品质和食用品质在育种过程中越来越受重视[16].类胡萝卜素是甜玉米中重要的微量营养元素，各组分均对人体有重要作用.在甜玉米籽粒中部分类胡萝卜素是维生素A的前体物质，可在人体内转变为具有生理活性的维生素A.玉米籽粒中可转化为维生素A的类胡萝卜素包括α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和β-隐黄质等[3, 17-20]，还有非维生素A前体成分玉米黄质和叶黄素，它们是眼睛合成黄斑色素的必要物质[20].甜玉米鲜食为主，更有一些水果型甜玉米可生食[21-22]，强化其营养品质、提高其微量营养元素含量对于增进人体健康有重要意义.
已有大量关于玉米类胡萝卜素的研究.Chander等[5]对中国的87份普通玉米自交系类胡萝卜素各组分含量进行了测定，β-胡萝卜素和总类胡萝卜素的质量分数均值分别0.449和10.298 μg·g-1，变异范围为0.016 ~ 1.726和0.096 ~ 22.495 μg·g-1.Harjes等[9]对204份黄玉米自交系的类胡萝卜素含量进行了测定，发现β-胡萝卜素和总类胡萝卜素质量分数的变化范围为0.06 ~ 13.6和5.5 ~ 6.6 μg·g-1.甜玉米的研究较少，Kurilich等[3]检测了44份甜玉米和普通玉米自交系，β-胡萝卜素和总类胡萝卜素质量分数的变异范围为0.07 ~ 7.64和0.15 ~ 33.11 μg·g -1.本研究中以47份甜玉米自交系为材料，发现β-胡萝卜素质量分数均值为0.88 μg·g-1，变幅为0.02 ~ 4.48 μg· g-1，总类胡萝卜素质量分数的均值为28.94 μg·g-1，变幅为1.44 ~ 75.98 μg·g-1，维生素A源质量分数均值为3.282 μg·g-1，变异范围为0.07 ~ 22.75 μg·g-1.表明甜玉米中的β-胡萝卜素和总类胡萝卜素含量存在丰富的变异，可利用甜玉米材料本身的β-胡萝卜素和总类胡萝卜素含量变异进行高维生素A源的新品种选育.
玉米中维生素A源自然变异已有大量研究，玉米类胡萝卜素合成的3个关键基因的鉴定克隆为玉米分子标记辅助选择奠定了基础，利用多个普通玉米群体进行功能分析的研究已有报道.Fu等[15]用2个群体对PSY1基因进行功能分析，发现上游的一个378 bp的Indel和第5外显子的一个SNP分别可解释7%和8%的总类胡萝卜素变异.Babu等[23]选用LCYE和CrtBR1基因的3个功能标记(5′Indel、3′Indel和3′TE)在26个热带遗传背景的普通玉米群体中进行了功能分析，发现CrtRB1基因的3′TE标记可使β-胡萝卜素和总类胡萝卜素含量分别增加2 ~ 10倍，LCYE基因的功能标记可导致α-胡萝卜素/β-胡萝卜素比值下降0 ~ 30%、增加维生素A源的含量.本研究中，单基因单倍型效应分析发现PSY1基因的Indel1和Indel4位点可解释玉米黄质和总类胡萝卜素含量表型变异的14.81%和13.00%，LCYE基因的5′Indel和3′Indel单倍型分别可解释β-胡萝卜素、维生素A源和总类胡萝卜含量表型变异的15.77%、20.75%和15.92%，而CrtRB1基因的3′TE在类胡萝卜素各组分中未检测出显著性差异.基于3个基因的联合单倍型效应除叶黄素含量无差异外，其余组分均达极显著水平，分别可解释β-胡萝卜素、维生素A源和总类胡萝卜含量表型变异的37.20%、40.71%和41.11%.其中LCYE和CrtBR1有利等位基因组成的单倍型类胡萝卜素各组分及维生素A源含量最高，与单基因效应值相比，基因间联合单倍型能够解释的各成分表型变异显著提高.与前人的研究相比，PSY1和LCYE有利等位基因在普通玉米和甜玉米中均对类胡萝卜素的合成有重要影响，其功能标记可用于育种分子标记辅助选择.
致谢:特别感谢中国农业大学国家玉米改良中心李建生教授对本试验的指导与支持！
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