2015, Vol. 36
2. 广西大学 生命科学与技术学院, 广西 南宁 530004
2. College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China
稻黄单胞菌水稻致病变种Xanthomonas oryzae pv. oryzae(Xoo), 俗称水稻白叶枯病菌, 属于革兰阴性菌的γ变形菌纲黄单胞菌属[1].该菌主要是通过叶片上的伤口与水孔进入水稻的维管组织中定殖、扩展, 最终导致感病品种罹患白叶枯病(Bacterial leaf blight, BLB)[1-2].水稻白叶枯病最早在日本九州岛被发现[3], 目前, 全世界种植水稻的国家或地区几乎都发生了水稻白叶枯病, 对水稻生产造成了严重的危害[2, 4]. Xoo的致病机理研究和BLB防治一直是植物病理学领域的研究热点, Xoo作为模式细菌在病原菌与植物互作分子机理研究方面发挥了重要作用[2].
Xoo与水稻之间的互作关系遵循基因对基因假说[5], 其分子机理是Xoo的类转录激活因子(Transcription activator-like, TAL)效应物与水稻的抗病或感病基因(启动子区)之间的相互作用[6-7]. TAL效应物的分泌和转运依赖于Xoo的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system, T3SS), 是一类Ⅲ型效应物(Type Ⅲ secretion effector, T3SE).除了TAL效应物外, Xoo中还具有另外一些T3SE, 非类转录激活子(nonTranscription activator-like, non-TAL)效应物[6].目前, 人们对Xoo的TAL效应物在病原菌致病中的作用机理已有了较为深入的了解[7], 而Xoo多数non-TAL效应物的功能或致病机制鲜见报道[6].已有试验证明, non-TAL效应物在丁香假单胞菌Pseudomonas syringae pv. syringae[9]、欧文氏菌Erwinia amylovora [10]、辣椒斑点病菌Xanthomonas campestris pv. vesicatoria[11]、十字花科黑腐病菌Xanthomonas campestris pv. campestris[12]等植物病原细菌的致病机制中发挥着重要作用.在Xoo中也发现了non-TAL效应物与致病相关, 在Xoo KACC10859菌株中, 效应物基因hpaF突变导致突变体致病力降低, 但不影响突变体的致敏性[13]; Xoo PXO99A中编码蛋白XopZ的基因突变后, 突变体的致病力显著下降[14].在Xoo MAFF311018菌株中证实了XopR与致病相关, 该效应物可抑制植物的早期防卫基因的表达[15].在Xoo 13751菌株xopR的同源基因突变, 同样导致相应突变体致病力显著降低[16].这些研究提示, non-TAL效应物在Xoo的致病过程中发挥着重要作用.
Xoo PXO99A菌株是目前全基因组测序完成质量最高的Xoo菌株[8, 17-18], 该菌株是最早分离于菲律宾Xoo的6号小种(PXO99)的5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine)抗性突变体, 作为鉴别菌株用于研究Xoo与水稻的互作机理[8, 19]. Xoo PXO99A菌株中包括至少42个已知和预测的Ⅲ型效应物[8], 其中包括19个TAL效应物基因和23个non-TAL效应物基因.广西大学植物病原细菌功能基因组学实验室对该菌株的non-TAL效应物基因进行了突变研究.其中1个基因hpaF, 位于hrp基因簇的hrpF基因的下游, 其编码的蛋白与茄科雷尔氏菌Ralstonia solanacearum PopC蛋白高度相似, PopC蛋白是1个具有多个LRR(Leucine-rich repeat domain)重复结构的蛋白, 与细菌在寄主植物上的致病过程相关[20].为了弄清该基因在致病中的作用, 本研究对Xoo PXO99A中被注释为non-TAL效应物的基因PXO_03420 (hpaF)进行了突变和表型分析.
1 材料与方法 1.1 材料菌株和质粒见表 1.供试寄主植物水稻为粳稻日本晴Oryza sativa L. japonica cv. Nipponbare, 由亚热带生物资源保护与利用国家重点实验室(广西大学)提供, 供试非寄主植物蓖麻Ricinus communis L.由广西壮族自治区蚕业技术推广总站提供.
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表 1 本研究所用的菌株和质粒 Table 1 The strains and plasmids used in this study |
大肠埃希菌Escherichia coli在LB培养基(1 L培养基含10.0 g胰蛋白胨, 5.0 g酵母提取物, 10.0 g氯化钠)中培养, 培养温度为37℃, 水稻白叶枯病菌Xoo在OB培养基(1 L培养基含2.00 g多聚蛋白胨, 5.00 g胰蛋白胨, 10.00 g蔗糖, 1.00 g谷氨酸钠, 0.10 g·L-1甲硫氨酸, 0.72 g磷酸氢二钾, 0.28 g磷酸二氢钾, 1.00 g氯化铵, 1.00 g六水氯化镁)或者NB培养基(1 L培养基含10 g胰蛋白胨, 1 g酵母提取物, 3 g多聚蛋白胨)中培养, 培养温度为28℃. LA、OA、NA培养基分别为LB、OB、NB培养基添加15 g·L-1琼脂粉的固体培养基.
抗生素的用量为:利福平(Rif)50 μg·mL-1、卡那霉素(Km)25 μg·mL-1、壮观霉素(Spc)25 μg·mL-1; 四环素(Tc)用量:大肠埃希菌15 μg·mL-1, 水稻白叶枯病菌5 μg·mL-1.异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG) 40 μg·mL-1, 5-溴-4-氯-3-吲哚-β - D-半乳糖苷(X-gal) 40 μg·mL-1.
根据PXO99A菌株的基因组序列设计PXO_03420基因上下游片段引物及互补片段引物(表 2), 用于PCR扩增. PCR扩增、质粒提取、总DNA提取、酶切及电泳等方法参见《精编分子生物学实验指南》[22].
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表 2 本研究中所用的引物 Table 2 The primers used in this study |
根据同源双交换的原理[21], 采用自杀质粒pK18mobsacB构建hpaF基因的缺失突变体.以PXO99A总DNA为模板, 扩增hpaF上下游片段, 回收后用相应的限制性内切酶酶切, 连接到相应酶切的pK18mobsacB质粒上, 转化至大肠埃希菌DH5α中, 经PCR验证, 测序后获得正确的重组质粒pK03420.通过三亲本结合的方法, 将重组质粒导入到PXO99A中, 涂布在NA + Rif + Km培养基上, 挑取单菌落, 在NB + Rif中培养, 诱导发生双交换, 然后涂布在NA + Rif +蔗糖150 g·L-1的培养基上, 挑取单菌落进行PCR验证, 将验证正确的突变体, 命名为DM03420.
构建并筛选互补菌株CDM03420.将含有hpaF基因全长的DNA片段连接到相应酶切的pLAFR3质粒上, 转化至大肠杆菌DH5α中, 经PCR验证测序后获得正确的重组质粒pL03420.通过三亲本结合的方法, 将重组质粒导入到DM03420中, 涂布在OA + Rif + Tc的培养基上, 挑取单菌落, PCR验证互补菌株CDM03420.pLAFR3空质粒导入突变体DM03420中作为对照, 命名为P03420.
1.2.2 胞外酶活性检测方法参照文献[23].将待测Xoo菌株接种至含有相应抗生素的OB液体培养基中, 28℃摇床培养16~18 h, 调节各菌液浓度一致(D600 nm=0.3);用微量移液器精确吸取2 μL菌液, 分别接种至含有10 g·L-1脱脂牛奶、1 g·L-1可溶性淀粉或者5 g·L-1羧甲基纤维素(CMC)的OA平板上, 在28℃培养箱中培养48 h.胞外蛋白酶的差异是通过观察脱脂牛奶平板上菌落周围透明圈的大小来比较的; 胞外淀粉酶是用稀释100倍的I2(母液0.08 mol·L-1)/KI(母液3.2 mol·L-1)染色液染色的方式通过水解圈的直径来比较胞外淀粉酶的差异; 胞外纤维素酶是用20 mL 1 g·L-1的刚果红溶液染色的方式通过水解圈的直径来比较胞外纤维素酶的差异.
1.2.3 胞外多糖产量检测方法参照文献[23].将待测Xoo菌株接种至含有相应抗生素的OB液体培养基中, 28℃摇床培养16~18 h, 调节各菌液浓度一致(D600 nm=0.3);用微量移液器分别精确吸取2 μL菌液, 接种至含有20 g·L-1葡萄糖的OA平板上, 28℃培养箱培养5 d, 根据菌落生长的外观观察各菌株合成胞外多糖的差异.
1.2.4 游动性检测方法参照文献[23].将Xoo待测菌株的新鲜过夜培养物用OB培养基调节浓度一致(D600 nm=0.3), 用微量移液器精确吸取2 μL菌液, 接种至含有3 g·L-1琼脂的OA半固体培养基平板上, 28℃培养箱静置培养5 d, 观察并照相记录.
1.2.5 致病性测定试验参照文献[16].选取处于分蘖期的水稻日本晴植株用于试验, 试验前1 d将水稻从露天盆栽场地移至28℃培养室以适应环境.选择长势一致, 距叶心最近的2片叶.采用剪叶接种法进行致病性检测:将待测菌株接种至10 mL加有相应抗生素的OB液体培养基中, 28℃摇床培养16~ 18 h, 将各待测菌株菌液浓度调节一致(D600 nm= 0.3), 用灭菌的剪刀沾取各菌液, 在距叶尖3 cm处垂直剪下叶尖, 接种后将水稻置于28℃温室培育.约两周后, 观察并测量病斑长度, 对照致病力分级比较野生型与突变体的致病反应.试验对照用ddH2O.将Xoo菌株待测试寄主植物幼苗分为3组, 每组处理30张以上的叶片, 每组随机抽取30张叶片进行病情调查.
1.2.6 过敏反应(HR)检测选取蓖麻嫩叶作为供试植株.取Xoo待测菌株的过夜培养物, 离心, 收集细胞, 弃去上清, 用微量移液器将残余的培养基吸干净, 并用无菌水重悬菌体, 将菌液稀释至D600 nm=0.3;用去针头的无菌注射器分别吸取各菌液, 将菌液压渗至蓖麻叶片背面的叶肉中, 形成大小一致的可见浸润斑; 接种后将蓖麻苗置于28℃温室中培育, 并用荧光灯照射, 每隔12 h观察并拍照记录过敏反应结果.
1.3 数据处理使用统计分析软件SPSS 21.0(http://spss.en.softonic.com/)进行数据处理, 计算平均值和标准差.
相对致病力=Xoo待测菌株病斑长度平均值/野生型菌株病斑长度平均值.
2 结果与分析 2.1 hpaF基因的生物信息学分析hpaF基因(PXO_03420)在水稻白叶枯病菌中被注释为XopAE效应物家族基因, 长度为1 437 bp, 转录方向为反方向, 编码的产物由478个氨基酸残基组成.该基因编码的蛋白为PopC类蛋白, 通过SMART在线软件分析可知, 该蛋白质序列存在多个富含亮氨酸重复结构域(LRR) (图 1).通过KEGG (http://www.genome.jp)网站上的序列分析与同源分析, 选取其中10个同源效应物基因, 均含有LRR结构域进行同源进化树分析, 采用MEGA5软件对hpaF基因及其近种同源基因进行进化关系分析(图 2), 发现hpaF基因在黄单胞菌属中相当保守, Xoo PXO99A中的hpaF基因与发表的Xoc BLS256中的XOC_4459基因也有很高的相似性.
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图 1 PXO_03420基因在基因组中的位置及蛋白结构域分析 Figure 1 The gene position and protein domain analysis of PXO_03420 |
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图 2 PXO_03420基因与同源基因进化关系分析 Figure 2 Phylogenic analysis of the homologues of PXO_03420 in Xanthomonas spp. |
基于自杀质粒pK18mobsacB构建hpaF基因的缺失突变体DM03420, 并对其进行了功能互补(图 3).
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图 3 hpaF缺失突变体和互补菌株的PCR验证 Figure 3 ldentification of the hpaF gene deletion mutant and the complemented strains by PCR M:100 bp DNA ladder plus; 1:PXO99A总DNA为模板的阳性对照(2 809 bp); 2~4:候选缺失突变体DM03420总DNA为模板扩增的产物(1 372 bp); 5:以PXO99A总DNA为模板的阳性对照(1 610 bp); 6:CDM03420的PCR扩增产物(1 610 bp); 7:以pLAFR3空质粒为模板的阴性对照. |
本研究对DM03420的致病因子胞外酶(胞外蛋白酶、胞外淀粉酶、胞外纤维素酶)、胞外多糖的产量以及游动性进行了检测, 结果发现, 野生型菌株PXO99A、突变体DM03420、互补菌株CDM03420胞外酶和胞外多糖的产量没有明显差异, 因此推测hpaF基因与水稻白叶枯病菌PXO99A胞外酶和胞外多糖的合成可能无关.
本研究采用半固体培养基平板检测法检测了Xoo菌株的运动情况(图 4、5).将菌液浓度一致的Xoo菌株接种至含3 g·L-1琼脂的OA培养基平板上, 28℃培养箱静置培养5 d.结果显示, 突变体DM03420游动的直径较野生型菌株PXO99A减小了46.62% (P < 0.05, t检验), 而互补菌株CDM03420游动的直径为野生型菌株PXO99A的76.9%, 导入空质粒pLARF3的缺失突变体P03420游动的直径与突变体DM03420无明显差异.这一结果表明, hpaF基因与水稻白叶枯病菌PXO99A的游动性相关.
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图 4 hpaF基因突变体与相关菌株的游动性检测 Figure 4 The motility test of hpaF mutant and other Xoo strains |
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图 5 hpaF基因突变体与相关菌株的检测结果 Figure 5 The motility test results of hpaF mutant and other Xoo strains |
剪叶接种检测了野生型菌株PXO99A、hpaF基因缺失突变体DM03420、互补菌株CDM03420及对照菌株P03420在寄主植物日本晴粳稻水稻上的致病力(图 6、7).统计学分析发现, 突变体DM03420在寄主植物上的致病力是野生型菌株PXO99A致病力的48.19% (P < 0.05, t检验), 互补菌株能够恢复部分致病力, 导入空质粒pLAFR3的缺失突变体P03420在寄主植物上的致病力与突变体的致病力没有明显差异.这一结果说明, hpaF基因与Xoo PXO99A在寄主植物上的致病相关.
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图 6 hpaF基因突变体与相关菌株的致病力检测 Figure 6 Virulence tests of hpaF mutant and other Xoo strains |
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图 7 接种hpaF基因突变体与相关菌株的水稻病斑长度 Figure 7 The lesion-length of rice innoculated by hpaF mutant and other Xoo strains |
检测野生型菌株PXO99A、hpaF基因缺失突变体DM03420、互补菌株CDM03420、对照菌株P03420在非寄主植物蓖麻叶片上HR反应(图 8).结果发现, 压渗24 h后, 接种野生型菌株PXO99A和互补菌株CDM03420的叶片出现了明显的组织坏死, 而接种突变体DM03420和P03420的叶片出现较弱的组织坏死斑, 接种ddH2O的叶片没有明显的变化.这一结果表明, hpaF基因突变后, 减弱了Xoo在非寄主植物蓖麻上引发的HR, 表明了hpaF基因与水稻白叶枯病菌PXO99A与非寄主植物的HR反应有关.
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图 8 hpaF基因突变体与相关菌株在蓖麻上的过敏反应(HR) Figure 8 The hypersensitive response tests of hpaF mutant and other Xoo strains on castor oil plant |
本研究通过构建Xoo PXO99A菌株的hpaF基因的缺失突变体, 并对该基因的功能进行了初步研究, 结果表明, hpaF基因突变体对水稻的致病力显著降低、对非寄主植物蓖麻的致敏性降低.一般认为, 一个病原菌的效应物在功能上具有一定的冗余性, 单独突变的基因表型往往会被其他同型基因功能补偿, 造成结果不明确[24].但也应看到, 如果单独突变具有显著的表型变化, 则提示该基因功能的重要和独特.本研究表明, hpaF基因在Xoo PXO99A菌株对水稻的致病机制中起主要作用.
有关hpaF基因突变体致病力降低的现象, 已在Xoo KACC10859菌株和大豆细菌斑疹病菌X. axonopodis pv. glycines, Xag 8ra菌株中报道[13, 25].同时, 在Xcc 8004菌株中, hpaF的非等位同源基因xopL (XC_4273)的突变体, 致病力也显著降低[12]. hpaF基因产物含有3个LRR结构的重复, 与茄科雷尔氏菌PopC蛋白高度相似, 雷尔氏菌的PopC蛋白是1个具有多个LRR结构的蛋白, 与细菌在寄主植物上的致病过程相关[20].本研究结果提示, 含有LRR结构域的蛋白质, 在植物病原细菌致病过程中发挥着重要作用.
本研究也发现hpaF基因突变不影响胞外多糖产生和胞外酶类活性, 表明hpaF基因不参与上述这类毒性因子的合成或分泌.但是, 令人意外的是hpaF基因突变导致了细菌游动能力明显降低, 提示hpaF可能影响了细菌的鞭毛或与运动相关的功能.这与常见的Ⅲ型效应物的作用不同, 通常情况下, Ⅲ型效应物进入寄主植物细胞后, 与寄主体内的蛋白质发生相互作用[6, 24].特别是, 细菌的LRR蛋白与植物中LRR结构具有同源性, 植物中LRR结构通过参与信号传导在植物发育与防御中发挥作用, 在拟南芥中许多具有LRR结构域的蛋白被证明与发育有关[26].可以肯定的是hpaF基因在Xoo PXO99A菌株中与致病相关, 但hpaF基因突变造成的病原菌运动能力对致病能力的影响究竟有多大, 现在还不清楚.
本研究结果表明Ⅲ型效应物基因hpaF具有多重生物学功能, 是水稻白叶枯病菌PXO99A中一个重要的致病相关基因, 为non-TAL效应物基因的研究提供了一定的基础.
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