夏季高温、高湿环境导致的热应激是影响家禽生产的主要环境因素之一.热应激会导致肉鸡采食、抗氧化力和免疫力的降低，从而严重影响肉鸡生产性能^[1].因此，深入了解热应激影响肉鸡生理反应的内在机制，是研发安全有效抗热应激剂的前提.

机体细胞内环境的改变所引发的内质网内蛋白的错误折叠、未折叠蛋白质在内质网腔内聚集以及Ca²⁺平衡紊乱的状态，称为内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS），而由此引发的提高内质网功能的反应即为非折叠蛋白反应（Unfolded protein re- sponse，UPR）^[2-3].研究表明，ERS和UPR与各种代谢和免疫功能紊乱密切相关^[4]，而热应激对肉鸡肝脏和肌肉中ERS和UPR有何影响还不清楚.骨骼肌纤维类型与肉品质密切相关^[5-6].最新研究报道，热应激能够改变猪背最长肌肌纤维类型的组成^[7]，而热应激能否影响肉鸡肌纤维类型鲜见报道.

本试验以黄羽肉鸡为研究对象，在研究热应激对肉鸡生长、血液生化指标以及抗氧化能力影响的基础上，进一步探索热应激对肉鸡肝脏和肌肉ERS和UPR以及腓肠肌肌纤维类型的影响，旨在揭示热应激导致肉鸡生理功能变化的内在机制，为研发能安全有效缓解热应激的营养调控物提供理论依据.

试验选用20只47日龄江村黄肉母鸡，按体质量相近的原则随机分为常温对照组和热应激组，每组10只，试验期为30 d.鸡只饲养在人工气候室中，热应激组环境条件为：白天（09：00-17：00）（36 ± 1）℃，晚上（17：00-翌日09：00）（24 ± 1）℃，湿度（75 ± 5）%.常温组环境条件为：全天（24 ± 1）℃，湿度（75 ± 5）%.所有试验鸡均饲喂基础饲粮.基础饲粮组成及营养水平见表 1.

表 1 Table 1

表 1 47 ~ 77日龄黄羽肉鸡基础饲粮组成及营养水平1） Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets for yellow feather broilers aged from 47 to 77 days

表 1 47 ~ 77日龄黄羽肉鸡基础饲粮组成及营养水平1） Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets for yellow feather broilers aged from 47 to 77 days

人工气候室（Conviron，加拿大），Bio-Rad MyCy- cler PCR仪（Bio-Rad，美国），HBPX220型梯度PCR仪（HYBRID，英国），Mx3005P荧光定量PCR仪（Sratagene，美国），γ放免计数器科大中佳GC-1200（科大创新股份有限公司），鸡笼等.总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒均购自南京建成生物有限公司.总胆固醇（TC）测定试剂盒购自北京北化康泰临床试剂有限公司.三酰甘油（TG）和血糖（GLU）测定试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司.血清激素：甲状腺激素（T₃、T₄）和胰岛素样生长因子1（IGF-1）测定试剂盒购自天津九鼎医学生物工程有限公司，皮质酮（CORT）ELISA检测试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司.

血液样品采集和检测：试验结束时，采集肉鸡血液于10 mL离心管中，离心分离血清，分装于1.5 mL离心管中，- 20 ℃冰箱中保存备用.利用试剂盒检测血清生化指标：TC、GLU、TP和ALB.利用放射免疫分析法检测血清激素：T₃、T₄和IGF-1；利用ELISA法检测血清激素CORT.利用试剂盒法检测血清抗氧化指标：MDA、GSH-PX和SOD.

组织样品采集和检测：处死肉鸡后，剪开腹部皮肤，暴露内脏，用小剪刀分离肝脏，滤纸吸干，于固定位置剪下0.5 g组织样，放入2 mL离心管中，每只鸡在同侧腓肠肌位置取样装入2 mL管，迅速投入装有液氮的液氮罐中.采样结束后转移样品至- 80 ℃冰箱中保存备用.利用试剂盒法检测肝脏抗氧化指标：SOD、GSH-PX、CAT和T-AOC.

取肝脏和腓肠肌样品分别抽提总RNA，使用一步法RNA抽提试剂TRIzol，常规方法抽提，用Oligo（dT）引物和AMV反转录酶进行反转录，RT-PCR反应体系为SYBR Premix Ex Taq，上、下游引物和cD- NA模板，以GAPDH为内参，荧光定量PCR法检测肝脏和腓肠肌中内质网应激相关因子基因，即热休克蛋白70（Heat shock protein 70，HSP70）基因、转录激活因子4（Activating transcription factor 4，ATF4）基因和鸡葡萄糖调节蛋白78（Glucose-regulated protein 78，GRP78）基因mRNA的表达.同时测定腓肠肌中慢肌肌球蛋白重链（Slow myofiber MyHC，MyHC-SM）基因、快红肌肌球蛋白重链（Fast red myofiber MyHC，MyHC-FRM）基因和快白肌肌球蛋白重链（Fast white myofiber MyHC，MyHC-FWM）基因mRNA的表达.相关基因的引物序列见表 2.

表 2 Table 2

表 2 荧光定量PCR所用引物序列 Table 2 The primer sequences used for real-time quantitative PCR

表 2 荧光定量PCR所用引物序列 Table 2 The primer sequences used for real-time quantitative PCR

试验结果用平均值±标准误表示.统计分析采用Sigmaplot 12.5软件分析，对热应激组和常温对照组的数值进行t检验.

慢性热应激对肉鸡生长、血清生化指标以及血清激素水平的影响见表 3.慢性热应激极显著（P＜0.01）降低肉鸡终末体质量和平均日增质量，说明慢性热应激对肉鸡生长具有显著的抑制作用.此外，慢性热应激对肉鸡血清的TC、GLU、TP和ALB的浓度无显著影响，但却显著（P＜0.05）降低血清TG浓度.慢性热应激可显著提高血清CORT的水平，但显著降低（P＜0.05）血清T₃、T₄和IGF-1的水平.

表 3 Table 3

表 3 慢性热应激对黄羽肉鸡生长、血液生化指标以及血清激素水平的影响1） Table 3 Effects of chronic heat stress on growth, serum biochemical indexes, and serum hormone levels of yellow feather broilers

表 3 慢性热应激对黄羽肉鸡生长、血液生化指标以及血清激素水平的影响1） Table 3 Effects of chronic heat stress on growth, serum biochemical indexes, and serum hormone levels of yellow feather broilers

由表 4可见，慢性热应激能显著提高（P＜0.05）血清MDA含量，同时极显著降低（P＜0.01）血清GSH-PX活性，而对血清SOD活性无显著影响.在肝脏中，慢性热应激能显著降低GSH-PX活性（P＜0.01）和T-AOC（P＜0.05），而对SOD和CAT活性无影响.

表 4 Table 4

表 4 慢性热应激对黄羽肉鸡血清和肝脏抗氧化指标的影响1） Table 4 Effects of chronic heat stress on serum and liver antioxidant indexes of yellow feather broilers

表 4 慢性热应激对黄羽肉鸡血清和肝脏抗氧化指标的影响1） Table 4 Effects of chronic heat stress on serum and liver antioxidant indexes of yellow feather broilers

如图 1A所示，慢性热应激对肉鸡肝脏ATF4和GRP78基因mRNA表达量无显著影响，但能显著升高（P＜0.05）肉鸡肝脏HSP70基因mRNA的表达.由图 1B可知，慢性热应激导致肉鸡腓肠肌HSP70和ATF4基因mRNA表达量显著升高（P＜0.05），而GRP78基因表达量显著降低（P＜0.05）.

图 1 慢性热应激对肉鸡肝脏（A）和腓肠肌（B）HSP70、ATF4和GRP78基因mRNA表达的影响 Figure 1 Effects of chronic heat stress on the mRNA expressions of HSP70, ATF4 and GRP78 genes in liver (A) and gastrocnemius muscle (B) of broilers *表示与对照组相比差异达0.05显著水平（t检验）.

如图 2所示，慢性热应激虽然对MyHC-FRM基因和MyHC-FWM基因mRNA表达无影响，但却显著降低（P＜0.05）MyHC-SM基因mRNA的表达.

图 2 慢性热应激对肉鸡腓肠肌不同肌纤维类型肌球蛋白重链基因mRNA表达的影响 Figure 2 Effects of chronic heat stress on the mRNA expressions of different types of myosin heavy chain in gastrocnemius muscle of broilers *表示与对照组相比差异达0.05显著水平（t检验）.

已有较多报道发现，高温导致的热应激会使鸡的生产性能显著下降^[8-9]，本试验中热应激导致肉鸡体质量和日增质量均极显著下降，与文献报道一致.李军乔^[10]研究发现，当肉鸡热暴露3周时，血液中三酰甘油含量显著降低，而血液中血糖、白蛋白、总蛋白水平无变化，本试验结果与上述报道一致.而热应激组血清三酰甘油含量显著降低，其可能原因是高温导致肉鸡营养不良、脂肪消化吸收障碍等.动物应激会引起体内应激激素的升高，本试验中也发现热应激可以显著升高肉鸡血清皮质酮水平，这与以往的报道相一致^[11].此外，本研究还发现，热应激导致IGF-1水平显著降低，而IGF-1与动物生长密切相关，因此，这与热应激显著降低肉鸡生长和体质量增加相一致.热应激还会降低肉鸡血液T₃和T₄水平^{[8, 12]}，进而影响动物的生长和代谢.而本试验中发现热应激显著降低血清T₃和T₄水平，一方面会抑制动物生长，另一方面降低机体能量代谢，减少热量产生.

本试验结果发现热应激显著升高肉鸡血清MDA含量，其反应是机体内自由基的增加，与以往报道一致^[10].而机体自由基的清除主要依靠体内各类抗氧化酶，包括SOD、CAT和GSH-PX等.本试验中，热应激会显著降低血清和肝脏中GSH-PX的活性以及肝脏中T-AOC，进而导致MDA含量的增加，这也与以往报道一致^[13-14].因此，在实际生产中，为了解决热应激造成的肉鸡抗氧化能力下降，可考虑在饲料中添加维生素类^[15]、氨基酸^[13]、铬^[16]等，缓解热应激对机体抗氧化能力的破坏.

高温环境不仅导致机体代谢失衡、抗氧化能力减弱和组织损伤，造成机体应激，产生热休克蛋白（如HSP70）^[17]，还可能破坏内质网的稳态造成内质网应激（ERS），此时细胞会启动UPR通路改变基因的转录和翻译过程来缓解内质网应激.GRP78是参与UPR通路的一种重要分子伴侣蛋白，ATF-4是UPR通路中一种重要的转录激活因子，二者在UPR信号通路起着关键作用^{[2, 4]}.本试验通过定量检测肝脏和肌肉组织中HSP70基因以及ERS和UPR相关因子基因的表达水平，来衡量机体抗应激能力和环境内质网应激能力.结果表明，热应激能显著提高肝脏和肌肉组织的HSP70基因表达量，有助于机体抗应激.与我们结果一致的是，李军乔^[10]也发现高温环境能提高肉仔鸡肝脏HSP72基因的表达.此外，我们还发现慢性热应激对肝脏ATF4和GRP78基因无显著影响，提示热应激后肝脏细胞URP通路变化并不明显.在骨骼肌中，慢性热应激显著增加ATF4基因表达量，同时降低GRP78基因的表达量.以上结果提示，热应激会导致肝脏和肌肉产生不同的ERS和UPR.2种组织之间的差异可能是因为肝脏组织代谢旺盛，ERS和UPR处于动态平衡过程中，而肌肉组织代谢相对缓慢，可能反映出机体自身长时间的抗应激状态.因此，添加外源分子伴侣或者其他功能性营养物来提高细胞UPR，进而缓解细胞ERS，是缓解肉鸡热应激的有效途径.

对于禽类，骨骼肌肌纤维一般分为3类：慢肌纤维、快红肌纤维和快白肌纤维^[18].肌纤维不同类型与肉鸡的肌肉品质密切相关，慢肌纤维含量多有助于提高禽类肉品质^[5].目前，有关热应激对肉鸡的肌肉品质影响的报道已有一些，但这些报道多集中于热应激对肉色、系水力、pH等指标的影响^{[10, 19]}，而有关热应激对肉鸡骨骼肌纤维类型的研究还比较少.我们采集肉鸡腿肌样品时，也发现热应激组鸡的腿肌颜色偏白，提示热应激可能对骨骼肌纤维类型有一定影响.为了验证这一假说，我们检测了肉鸡腓肠肌中不同肌纤维类型（慢肌、快红肌和快白肌）肌球蛋白重链（Myosin heavy chain，MyHC）基因mRNA的表达.结果表明，热应激虽然对快红肌和快白肌MyHC基因mRNA表达无影响，但却显著降低慢肌MyHC基因mRNA的表达，提示热应激可降低肉鸡腓肠肌中慢肌纤维的比例，从而降低肉鸡肌肉品质.有研究报道，持续的中度热应激会诱导小鼠C2C12细胞系^[20]和人成肌细胞^[21]由快肌向慢肌分化，这与我们的试验结果相反.其原因可能是禽类与哺乳类之间存在物种差异，另外细胞与活体试验之间条件的差异也会导致结果不同.

综上所述，慢性热应激会抑制黄羽肉鸡生长、降低机体抗氧化能力，导致肉鸡出现内质网应激，并能减少肉鸡腓肠肌慢肌MyHC基因表达量，从而降低黄羽肉鸡肌肉品质.以上结果揭示了热应激导致肉鸡生理功能变化的内在机制，为针对性地研发能够提高机体抗氧化能力、缓解内质网应激的营养调控物提供了理论依据.