鱼类线粒体基因是遗传信息重要的载体，具有母系遗传、进化速度快等特点，是研究种群遗传结构的理想材料^[1-2]；线粒体控制区又称D-环区(Dloop)，其进化速度最快，是mtDNA其他区段的5~10倍^[3]，遗传变异大，是种群遗传多样性研究的常用标记之一，很适合做种内、种群或个体间的遗传分化研究^[4]。

长臀属Cranoglanis是东亚和南亚特有属，原在中国的珠江水系和海南水系以及越南的红河水系很常见，由于其人工繁殖技术还不成熟^[5-6]，尚不能为水产市场提供稳定的苗种，因此一直以来其苗种主要通过野外捕捞获得，以致长臀野生资源枯竭，已被列入《中国濒危动物红皮书》^[7]，面对长臀如此严峻的野生资源状况，通过分析其种群结构和遗传多样性，进而对其野生资源状况进行客观的评价显得尤为重要，纵观国内外研究现状，仅有少数学者对长臀分布区的部分群体进行了研究，乐小亮等^[8]通过cytb 基因以及高志远等^[9]通过线粒体控制区仅对海南群体遗传变异进行了研究，程飞等^[10]通过AFLP和微卫星也只研究了海南和珠江2个群体，本研究采集珠江、海南和越南红河3个群体，通过线粒体控制区对3个区域的长臀遗传结构和遗传多样性进行分析，并对长臀3个群体的野生资源现状进行客观评价。

自1927年Koller^[11]在海南发现一新种Pseudeutropichthys multiradiatus Koller以来，长臀的归属问题一直饱含争议；Myers^[12]认为Pseudeutropichthy和Cranoglanls为同物异名，故将Koller发现的新种改名为Cranoglanis multiradiatus，但认为C. sinensis和C. multiradiatus为不同的2个种，并建立了长臀科Cranoglanididae; Jayaram^[13]认为两者是同物异名，均属于长臀C.bouderius；褚新洛等^[14]则认为二者应作为1个种的2个地理亚种更为合理；Ng等^[15]却认为除上述2个种外，还包括越南红水河水系的红河长臀C. henrici；刘彩霞^[16]采用传统形态度量学方法，认为长臀属只有1个有效种，即C.bouderius；程飞等^[10]通过AFLP和微卫星标记仅对海南和珠江2个群体进行了分析，认为二者为同一种。本研究通过线粒体控制区，对长臀3个种群遗传分化和遗传距离进行分析，旨在为长期存在争议的长臀物种有效性提供可靠的分子生物学依据。

1 材料与方法 1.1 材料

珠江长臀C. bouderius鳍条样品于2013年3—9月分别采自广东省清远市清新县源潭镇境内北江流域(9条)、佛山九江流域(8条)和广西西江上游红水河流域(7条)，共采集样本24条；红河长臀 C. henrici鳍条样于2014年6月20日采自与云南河口交界的越南红河流域，共采集样本30条；海南长臀C. multiradiatus鳍条样于2014年7月20日采自海南省儋州市南丰镇松涛水库番加乡、南丰镇和白沙3个区域，共采集样本30条，样本采集是随当地渔民出船捕捞购得，体长介于15~25 cm，新鲜采集的鳍条样品储存于体积分数为95%乙醇溶液中，带回实验室放置于-20 ℃冰箱中保存。

组织样品DNA提取试剂盒为TIANGEN生化科技有限公司产品、Tap DNA聚合酶为TaKaRa有限公司产品，其他试剂均为分析纯。引物由上海捷瑞生物公司合成，测序由上海英骏公司完成。引物根据NCBI上已有长臀线粒体全长序列(GenBank序列号：NC_008280.1)设计Dloop引物序列；Dloop F：5′-CTAAATCTTAATGTCTTCGACATGC-3′，Dloop R：5′-GGTTTGACAGGATAAATTAGGACTC-3′。

1.2 方法 1.2.1 长臀鳍条样DNA的提取

取30 mg左右鳍条样品，于蒸馏水中漂洗数次，用滤纸吸干表面水分，放入1.5 mL离心管中，用剪刀剪碎，加裂解液，在55 ℃水域中直至裂解完全，按TIANGEN组织DNA提取试剂盒说明书进行操作，然后琼脂糖凝胶电泳检验提取效果，于-20 ℃条件保存供后续试验。

1.2.2 长臀Dloop PCR扩增

PCR反应体系总体积为50 μL，其中包括10×Buffer 5 μL，dNTPs (2.5 mmol·L^-1) 4 μL，上、下游引物各1 μL，Ex Taq酶(1 U·μL^-1) 2 μL，模板1 μL，用双蒸水补足50 μL。Dloop PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后，取2 μL PCR产物做琼脂糖凝胶电泳，检验目的基因质量，然后送上海英骏生物公司测序鉴定。

1.2.3 序列分析

测序结果同NCBI上序列比对分析后，用Clustal X软件进行排序，并进行手工校正^[17]。MEGA 5.0软件统计序列的碱基组成、变异位点数、简约信息位点以及群体间的遗传距离^[18]；用DnaSP 5.0计算单倍型多态性和核苷酸多样性等遗传多样性指数^[19]。利用Arlequin3.5中性检验和核苷酸不配对分布2种方法来检测长臀的群体历史动态^[20]。

2 结果与分析 2.1 长臀DLoop基因序列的组成及变异

采用Clustal X软件分别对长臀3个群体进行序列比对，去除两端冗余序列，珠江长臀、海南长臀和红河长臀得到可分析序列长度分别为742、734和734 bp，3个群体序列组成和变异结果见表 1；长臀Dloop序列多态性两端较高，中间256~531 bp相对保守，其中多态性最高的区域为532~633 bp；共发现3个保守区域AAAATCGCATAATTCCCTTAACATTTCATG(177~206 bp)、GGGTCACACTCCTCACACTATTTCTGGCATCTGGTTCCTATTTCA(329~373 bp)和ACCTCGTTCTAGCAAAAACCCCCCATGCCAAGGCATTCTTTAACAG(434~479 bp)。

2.2 长臀种群的遗传结构分析

采用DNAsp5.0和Arlequin3.5软件对3个长臀种群84个个体的Dloop序列进行分析, 共检测出43个单倍型, 其中珠江种群20个, 海南种群11个, 红河种群18个；3个群体间无共享单倍型，红河和珠江种群有6个共享单倍型，海南种群11个单倍型均为特有单倍型(表 2)；对各群体的遗传变异参数进行统计, 结果如表 3所示, 对比各群体单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数以及平均核苷酸差异数发现，海南长臀3个指标值均最低，说明海南群体遗传多样性水平较低。对长臀3个种群进行中性假说检验结果表明, 除珠江长臀Fu’Fst检验达到显著外(P < 0.05)，其他种群均不显著(P > 0.05)(表 3)。结合核酸不配对曲线可以发现，3个群体均呈多峰曲线分布，与其Tajima’s D检验不显著结果相符，表明3个群体大小稳定，无明显的群体扩张(图 1)。

2.3 长臀种群遗传距离估算和聚类分析

采用Mega5.0对长臀3个种群间的净遗传距离进行估算，结果如表 4所示，珠江与海南的净遗传距离为0.001，海南与红河的净遗传距离大于珠江与海南为0.003；长臀3个群体的平均遗传距离为0.014，海南种群间的遗传距离最小为0.006，显著小于珠江种群间的遗传距离(0.015)及红河种群间的遗传距离(0.018)；对3个群体间的遗传分化指数进行计算也发现，海南与珠江以及红河与海南的遗传分化指数达到显著(P < 0.05)，而红河与珠江之间的遗传分化指数不显著，说明海南长臀群体同珠江、红河群体间产生了一定的遗传分化。采用Mega5.0软件对84个个体进行NJ聚类分析，并采用Bootstrap(重复次数1 000)检验聚类树各分支置信度，结果如图 2所示，3个种群84个个体间未形成明显的谱系结构，各地理种群散乱无序的分布于各分枝，无明显的地理聚群，未发现明显的地理结构。

3 讨论 3.1 长臀种群的遗传多样性

遗传多样性是物种不断进化适应环境的基础，是评价生物资源状况的重要依据，遗传多样性的降低或丧失, 会对野生群体的资源状况造成极大威胁。采用Dloop基因序列对长臀珠江水系、海南水系和越南红河水系3个种群遗传结构分析发现，3个种群均表现出单倍型多样性高、核苷酸多样性低的现象(珠江Hd=0.978，Pi=0.014 7；海南Hd=0.871，Pi=0.006 4；红河Hd=0.963，Pi=0.018 6)，其中海南群体Hd和Pi都小于其他2个群体，3个种群遗传多样性与中国香鱼^[4]、青海湖裸鲤^[21]、圆口铜鱼^[22]、刀鲚^[23]、铜鱼^[24]水平相当；通过考察群体的核苷酸不配对曲线是否单峰型或多峰型、是否偏离中性检验，可以推测过去群体是否发生过扩张^[25]，长臀3个群体Tajima’s D检验不显著(P > 0.10)和核酸不配对曲线呈多峰曲线分布，表明长臀3个群体保持稳定，未出现大规模扩张；由上述结果可见，长臀群体的遗传多样性总体上比较贫乏。珠江水系和越南红河水系的长臀较海南长臀有更多基因交流的机会，海南长臀处于海南岛，四面环海很难与外界产生基因交流；长臀尚未实现大规模的人工繁殖，其种苗大部分靠野生苗种捕捞，长臀野生资源的匮乏，也是造成长臀野生资源遗传多样性贫乏的原因。海南长臀遗传多样性贫乏程度较其他2个群体更胜，应加强海南岛野生长臀资源的保护，建立长臀保护区刻不容缓^[9]。

3.2 长臀种群的分化和地理格局

长臀3个种群84个个体共检测到43个单倍型，珠江种群和红河种群有6个共享单倍型，海南11个单倍型均为特有单倍型；3个群体平均遗传距离0.014，珠江和红河的净遗传距离为0.000，海南和红河的净遗传距离(0.003)大于海南和珠江(0.001)，西江上游红水河与南盘江相连，而南盘江又与云南元江相接，元江的下游流进越南境内称红河，故珠江长臀所在的水系和红河长臀所在水系相连，基因交流较四面环海相对封闭的海南岛频繁，另外广西、云南与越南相邻，据调查，当地很多野生长臀苗种购自越南，加速了2个群体的基因交流，3个群体遗传距离的差异与地理分布相符。3个群体遗传分化指数也显示，海南长臀同珠江、红河2个群体有显著的遗传分化，而珠江和红河没有，说明海南长臀由于和珠江、红河地理上的隔离，在漫长的进化过程中已经慢慢产生了遗传分化。基于Dloop基因构建长臀NJ进化树发现，3个群体散乱分布于各枝，未出现明显的地理聚群，但从进化树上可见珠江和红河2个群体有更多的交集。综上所述，海南长臀同珠江长臀和红河长臀产生了一定的遗传分化，但很缓慢。

3.3 长臀属鱼类物种有效性分析

长臀3个种群的物种有效性一直存在争议，褚新洛等^[14]在中国动物志硬骨鱼纲鲇形目中认为不同地理种群的形态差异与其分布地区有一定的联系，故将采自云南元江(红河)和海南的C. multiradiatus和珠江长臀C. bouderius作为1个种的2个亚种；Ng等^[15]在整理采自越南北部红河水系的长臀属鱼类时，与我国长臀属鱼类进行了比较，则认为长臀属有3个有效种：珠江长臀C. bouderius、海南长臀C. multiradiatus和红河长臀C. henrici。刘彩霞^[16]采用形态度量学方法对分布于我国珠江水系、元江水系及海南岛诸水系的长臀属3种鱼类，共66尾个体的43个测量性状进行了主成分分析，其研究结果认为虽然3个种群长臀可数性状存在少许差异，但并不能从形态上进行区别，认为长臀属只存在1个有效种。另外, 程飞等^[11]采用AFLP分子标记技术对珠江长臀和海南长臀共60个个体进行了遗传多样性研究，认为两者遗传差异属于种内差异, 认为两者同属1个有效种。线粒体控制区其进化速度最快，是mtDNA其他区段的5~10倍，本研究从线粒体控制区Dloop基因对长臀3个种群物种有效性进行分析，红河和珠江长臀的净遗传距离为0.000，海南和珠江、红河的净遗传距离也较小(0.001、0.003)；从遗传分化系数结果来看，珠江种群和红河种群无显著的遗传分化，海南长臀虽然与其他2个群体产生了一定的遗传分化，但远没达到一个新种的遗传距离。本研究结果认为，应将珠江长臀和红河长臀归为同一个亚种长臀Cranoglanis bouderius，海南长臀Cranoglanis multiradiatus归为长臀的另一个亚种。