水稻Oryza sativa L.是我国主要的粮食作物，两系杂交水稻在保障我国粮食安全中发挥着重要作用^[1]。自20世纪80年代发现光温敏核不育水稻以来^[2]，经过30多年的研究，有关两系杂交水稻的理论与技术已取得较大的进展, 并已育成一批强优组合在生产上推广应用^[3]。但由于光温敏核不育系的育性会随着光温条件的改变而变化，这使杂交水稻由三系变成两系成为可能的同时，也使不育系存在育性不稳定的潜在危险。特别是制种季节不育系的不育性易受异常低温的影响而导致自交结实，使得两系杂交水稻种子不纯，给农业生产造成巨大损失^[4-6]。如2009年江苏、安徽、四川等地两系杂交稻制种，育性敏感期遇到24 ℃左右的持续低温，近6 700 hm²制种田的不育系出现育性波动而导致制种失败，直接经济损失近亿元^[7]。如何有效减少异常低温对光温敏核不育系育性的影响已成为两系杂交稻研究和应用中必须解决的核心问题^[8]。前人的研究表明，不同的光温敏核不育系不仅育性转换的临界温度不同，而且其育性转换所需临界温度的持续时间也不同^[9-10]，甚至育性转换临界温度相同或相近的不育系，其育性对低温持续时间的耐受度也存在差异^[11]。基于光温敏不育系育性转换与光温变化关系的基本规律，袁隆平^[12]指出选育实用光温敏核不育系最关键的技术指标是不育起点温度要低(华南地区≤24 ℃、长江流域及以北地区≤23 ℃)，并且在低于临界温度时需要较长时日恢复可育的不育系才具有实用价值。因此，要降低两系杂交水稻受异常低温影响的制种风险，需注意选育不育临界温度低且耐受低温时间长的不育系^[13]。本研究以光温敏核不育系籼S、N28S、安农S、培矮64S、N9S和N2S为材料，在人工气候箱内通过不同程度低温处理不同时间，研究这些不育系的不育性对短期低温的耐受度差异，为不育性稳定的光温敏核不育系的选育及生产应用提供依据。

水稻光温敏核不育系：籼S、N28S、安农S、培矮64S、N2S和N9S，其中籼S、N28S、安农S主要以无花粉的方式败育，培矮64S、N2S和N9S主要以典败的方式败育(图 1)。

图 1 6个光温敏核不育系的花粉败育方式 Figure 1 Pollen abortion types of six PTGMS lines in rice 1为正常对照籼黄占，示成熟花药室内充满正常可育花粉；2~4分别为籼S、N28S、安农S，示成熟花药室内没有花粉产生的无花粉型败育方式；5~7分别为培矮64S、N9S、N2S，示成熟花药室内充满不规则形状的空瘪花粉的典败型败育方式。

将供试材料分批播种，每隔10 d播1批。当主穗进入幼穗分化期第Ⅳ期晚期(雌雄蕊原基分化期)时，将各不育系的单株分别定植于长60 cm、宽32 cm的塑料盆中，每盆6株，每处理2盆。在室外放置3、5、6 d后移入华南农业大学测试中心的人工气候箱分别进行3、7、10 d的21和23 ℃低温处理。光照时间为13.5 h，温度设为加权平均值，具体各时段的温度设置见表 1。人工气候箱内RH≥75%、光照度为1.0×10⁴ lx。低温处理后搬出人工气候箱，在室外自然条件下抽穗。从抽穗开始每天取样调查花粉育性，每次取样3株，取当天已抽出1/3~2/3穗子的上部穗3~6朵未开的颖花用FAA液固定。镜检时每株颖花混合压片，用10 g·L^-1的I₂-KI染色，10×10倍显微镜下观察3个视野，记录各视野花粉可染率，统计求其平均值。将花粉圆形、大小正常、染色深而均匀的计为正常可育、其他各类均计为败育，包括无花粉、典败、圆败、染败；一般持续30 d。将各处理所得的花粉可育率进行反正弦代换，然后用SPSS10.0软件进行统计分析。

表 1 Table 1

表 1 人工气候箱各时段温度设置 Table 1 Temperature settings of different times in plant growth chamber

表 1 人工气候箱各时段温度设置 Table 1 Temperature settings of different times in plant growth chamber

由表 2可知，在21 ℃下，经过3 d持续低温处理的籼S有4 d从无花粉型不育转为典败型不育；经过7 d持续低温处理的籼S有一段时间的典败和圆败花粉，但花粉可育率仍为0；经过10 d持续低温处理的籼S会有6 d出现可育花粉，最高花粉可育率达89.00%。在23 ℃下，经过3、7 d的持续低温处理，籼S的花粉可育率为0，并且3 d低温处理的花粉镜检仍为无花粉型不育；经过10 d的持续低温处理籼S有4 d出现可育花粉，但最高花粉可育率仅为2.00%。

表 2 Table 2

表 2 不同低温持续时间对籼S花粉可育率的影响1) Table 2 Effects of low temperature and duration on the pollen fertility rate of XianS in plant growth chamber

表 2 不同低温持续时间对籼S花粉可育率的影响1) Table 2 Effects of low temperature and duration on the pollen fertility rate of XianS in plant growth chamber

由表 3可知，N28S的花粉育性变化与籼S相似。在21 ℃下，表现为持续低温处理3、7 d并不能使其花粉可育，持续低温处理10 d有6 d出现可育花粉，最高花粉可育率为89.33%。在23 ℃下，表现为3、7 d的持续低温处理花粉可育率为0；10 d的持续低温处理有3 d出现可育花粉，但最高花粉可育率仅为1.33%。

表 3 Table 3

表 3 不同低温持续时间对N28S花粉可育率的影响1) Table 3 Effects of low temperature and duration on the pollen fertility rate of N28S in plant growth chamber

表 3 不同低温持续时间对N28S花粉可育率的影响1) Table 3 Effects of low temperature and duration on the pollen fertility rate of N28S in plant growth chamber

由表 4可知，安农S的花粉育性变化与籼S、N28S有所不同。21 ℃持续低温处理3 d的花粉可育率为0，镜检发现，有一段时间的典败和圆败花粉；持续低温处理7 d出现连续4 d的可育花粉，可育率最高达到46.33%；持续低温处理10 d的花粉可育天数和最高花粉可育率分别增至7 d和93.33%。在23 ℃下，安农S经过3、7、10 d低温处理后的花粉育性变化趋势与21 ℃相同，也是低温处理3 d的花粉可育率为0，低温处理7 d的有连续4 d的可育花粉，但最高花粉可育率仅为17.00%；持续10 d的低温处理与7 d相比，花粉可育天数增加1 d，花粉可育率增加至80.67%。

表 4 Table 4

表 4 不同低温持续时间对安农S花粉可育率的影响1) Table 4 Effects of low temperature and duration on the pollen fertility rate of AnnongS in plant growth chamber

表 4 不同低温持续时间对安农S花粉可育率的影响1) Table 4 Effects of low temperature and duration on the pollen fertility rate of AnnongS in plant growth chamber

由表 5可知，在21 ℃下，持续低温处理3 d的培矮64S有连续6 d出现可育花粉，最高花粉可育率为18.33%；经过7、10 d的持续低温处理，培矮64S的花粉可育天数分别增加到7和8 d，花粉可育率分别提高到45.00%和85.67%。在23 ℃下，培矮64S经过3 d持续低温处理后的花粉育性为0；经过7、10 d持续低温处理后，均出现连续4 d的可育花粉，但10 d的最高花粉可育率为37.67%，比7 d的花粉可育率11.33%要高。

表 5 Table 5

表 5 不同低温持续时间对培矮64S花粉育性的影响1) Table 5 Effects of low temperature and duration on the pollen fertility rate of Peiai64S in plant growth chamber

表 5 不同低温持续时间对培矮64S花粉育性的影响1) Table 5 Effects of low temperature and duration on the pollen fertility rate of Peiai64S in plant growth chamber

由表 6可知，在21 ℃下，N9S的花粉育性变化与培矮64S相似，持续3 d的低温处理就会使N9S的花粉转为可育，最高花粉可育率为16.33%；持续7、10 d低温处理的N9S出现可育花粉的天数分别为5、6 d，最高花粉可育率分别为35.00%、80.00%。在23 ℃下，N9S的花粉育性变化与培矮64S有所不同，低温处理3 d就出现可育花粉，最高花粉可育率为4.00%；经过持续7、10 d低温处理的N9S与培矮64S一样，也是都出现连续4 d的可育花粉，最高花粉可育率分别为14.00%、51.67%。

表 6 Table 6

表 6 不同低温持续时间对N9S花粉可育率的影响1) Table 6 Effects of low temperature and duration on the pollen fertility rate of N9S in plant growth chamber

表 6 不同低温持续时间对N9S花粉可育率的影响1) Table 6 Effects of low temperature and duration on the pollen fertility rate of N9S in plant growth chamber

由表 7可知，在21 ℃下，N2S的花粉育性变化与N9S一样，3 d的持续低温处理就使其花粉转为可育，最高花粉可育率为12.33%；持续7、10 d低温处理的N2S出现可育花粉的天数都为7 d，最高花粉可育率分别为37.00%、86.33%。

表 7 Table 7

表 7 不同低温持续时间对N2S花粉可育率的影响1) Table 7 Effects of low temperature and duration on the pollen fertility rate of N2S in plant growth chamber

表 7 不同低温持续时间对N2S花粉可育率的影响1) Table 7 Effects of low temperature and duration on the pollen fertility rate of N2S in plant growth chamber

综合不同光温敏核不育系经过21和23 ℃低温处理不同时间后的花粉育性变化可以看出：各不育系对低温耐受程度的强弱次序是籼S、N28S > 安农S > 培矮64S > N9S、N2S。在这些不育系中，籼S、N28S和安农S是无花粉型不育系，培矮64S、N9S和N2S是典败型不育系，并且除安农S的不育起点温度为25 ℃以上外，其他不育系的不育起点温度均为23.0~23.5 ℃。供试的光温敏核不育系表现出无花粉型不育系比典败型不育系、低不育临界温度不育系比高不育临界温度不育系对短期低温的耐受度强的趋势，并且所有不育系的花粉育性受低温的影响程度都是随着低温持续时间的延长和低温强度的加大而加强的，表现为花粉可育天数和花粉可育率的增加。

长期的研究和生产实践表明，不育系育性转换的光温反应特性是光温敏核不育系生产利用的关键。选育不育期败育彻底、不育性稳定的光温敏核不育系是目前两系法杂交稻制种安全的重要保证^[14]。降低两系法杂交稻制种风险的关键技术是使用不育起点温度低、耐受低温时间长的实用型光温敏核不育系^[13]。李必湖等^[11]通过对不同温敏核不育系的低温持续时间敏感性差异研究，认为不育系的遗传背景、育性转换的不育临界温度与其不育性对低温的敏感性存在一定的相关性。本研究通过对光温敏核不育系籼S、N28S、安农S、培矮64S、N9S、N2S的低温耐受度分析发现，不育起点温度为23.0~23.5 ℃的无花粉型不育系籼S和N28S分别能够耐受21 ℃低温7 d和23 ℃低温10 d，不育起点温度超过25 ℃的无花粉型不育系安农S只能够耐受21和23 ℃低温3 d，而不育起点温度为23.0~23.5 ℃的典败型不育系培矮64S、N9S和N2S，除培矮64S经23 ℃低温处理3 d的花粉不育外，其他处理均出现可育花粉，并且低温强度越大，花粉可育度越高。由此认为，光温敏核不育系的低温耐受度除与不育起点温度有关外，还可能与不育系的花粉败育方式有关。但是对于如安农S这类不育起点温度高的无花粉型不育系，即使对短期低温反应钝感，在生产应用中也不能解决制种的安全问题。而如籼S和N28S这类不育起点温度低且不育性对短期低温反应钝感的不育系，在制种季节即使遇到连续7 d日均温21 ℃或连续10 d日均温23 ℃的异常低温天气，花粉育性也不会波动，不育性仍然稳定，制种风险小，在生产上更有实用价值。因此，在实用型光温敏核不育水稻的选育过程中，可多注意对低不育临界温度无花粉型不育系的选育。另外，值得注意的是本研究中无花粉型不育系籼S、N28S和安农S的不育基因是等位的^[15]，目前该基因已被证实为 RNaseZ^S1，并且广泛存在于温敏核不育系中^[16-17]，该基因在两系杂交水稻生产中发挥了重要作用，并且可在多种遗传背景中表达，说明利用分子标记辅助选择育种是可行的。