苦楝Melia azedarach又名翠树、楝树、紫花树、森树等，为楝科楝属落叶乔木，分布于中国、韩国、日本、印度、斯里兰卡、印度尼西亚和澳大利亚等地，欧洲、美洲也有栽培^[1]。苦楝生长速度快、木材材质优良、纹理美丽，易加工，可用于家具、建筑、农具、船舶、乐器等方面，木材抗白蚁、抗虫蛀、耐腐。苦楝耐烟尘、能大量吸收有毒有害气体，是优良的城市及工矿区绿化树种，也是我国南方四旁绿化常用树种^[2-3]。苦楝的根、皮、花、果均可入药，也可作为植物源农药^[4]。分子标记是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术^[5~6]。目前已有少量文献对部分苦楝种源的遗传多样性进行分析，程诗明^[7]采用7对AFLP引物对分层随机抽样的8个群体240个个体基因组进行研究分析，共扩增得到658条清晰谱带，其中650条为多态性谱带，各群体多态位点百分率为51.4%~76.29%；陈羡德^[8]利用筛选出的20个RAPD引物对15个不同来源的苦楝进行分析，20个随机引物共扩增出193条重复性好、清晰的谱带，其中多态性谱带共计189条，占97.9%。夏海涛^[9]采用筛选出的24个简单重复序列间多态性(Inter-simple sequence repeat，ISSR)引物对13个种源苦楝优树DNA进行分析，共扩增出382个位点，多态位点百分率为98.43%，其中南宁和仓山种源的多态位点百分率最高，为54.97%，延平的多态位点百分率最低，为43.98%，说明13个种源苦楝的遗传多样性丰富。但是，苦楝分布广泛，以前的研究采样点偏少，不足以准确地反映全分布区苦楝的遗传多样性。本项研究从国内18个省(区、市)37个县(市)采集苦楝种子，并收集肯尼亚内罗毕苦楝种子，采取相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism, SRAP)分子标记方法进行遗传多样性分析。此外，SRAP分子标记结合了扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism, AFLP)及随机扩增的多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)各自的优点，方便快速，只需要极少量DNA材料，且不需要预先知道DNA序列信息，即可快速获得大量的信息，试验结果稳定可靠，且再现性较高，重复性较好^[10~11]。

1 材料与方法 1.1 试验材料

以国内全分布区的37个种源和肯尼亚内罗毕1个种源为对象进行苦楝SRAP遗传多样性分析，采种点地理位置及编号见表 1。试验材料采于广州市华南农业大学苗圃1年生苦楝，采集幼嫩枝条上嫩叶6~8片，低温保存用于提取DNA。

1.2 试验仪器与设备

试验仪器主要有超微量紫外分光光度计(Thermo nanodrop 2000)，PCR扩增仪(PTC-200)，DYY-Ⅲ型恒压恒流电泳仪(北京六一仪器公司)，凝胶成像系统(Bio-rad)，高速离心机(Eppendorf)等。试验用TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺及100 bp DNA ladder等购自TaKaRa公司，琼脂糖和Gold View核酸染料购自广州鼎国生物科技有限公司，酚、三氯甲烷、乙醇、异丙醇、硫代硫酸钠、硼酸、甲醛、冰醋酸、硝酸银等其他试剂为国产分析纯。SRAP引物由上海生工生物工程有限公司合成，本研究所用引物序列见表 2。

1.3 苦楝DNA提取和SRAP-PCR扩增

苦楝基因组DNA提取参照上海生工生物工程有限公司柱式基因组DNA提取试剂盒说明书。所提取的基因组DNA用8 g·L^-1琼脂糖凝胶电泳检测质量，超微量紫外分光光度计检测浓度后稀释至50 ng·μL^-1，置于-20 ℃条件下保存备用。通过单因子及正交试验建立并优化苦楝SRAP-PCR最佳反应体系为模板DNA 30 ng、dNTPs浓度0.125 mmol·L^-1、Mg²⁺浓度2.25 mmol·L^-1、引物浓度0.48 μmol·L^-1、Taq DNA聚合酶0.75 U(25 μL)。SRAP-PCR反应程序为: 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，35 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，5个循环；94 ℃变性1 min，50 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。

1.4 数据统计与分析方法

电泳结果统计时将具有相同迁移率的扩增片段，按0/1系统纪录，有带记为1，无带记为0，并参照标准Marker带估计扩增片段的大小，形成0/1矩阵。将图形资料转换成数据资料，并输入Excel 2007中建立0/1数据矩阵，使用NTSYS-pc2.10e软件计算遗传距离和相似系数，使用非加权平均法(UPGMA)进行聚类分析。

2 结果与分析 2.1 SRAP扩增多态性条带统计

本研究采用20对SRAP引物对苦楝38个不同种源进行扩增，分析结果见表 3。由表 3可知，引物扩增条带多数集中在100~1 500 bp之间，20对引物组合对全部样品进行分析，共扩增出247条带，其中多态性条带101条，平均多态性百分率为40.89%。20对引物扩增的条带数从5条(Me11/Em29)到17条(Me20/Em7)不等，平均为12.1条。多态性条带的数量从1条(Me11/Em29、Me6/Em29)到12条(Me20/Em7)不等，多态性比率最高的引物组合为Me24/Em14(88.89%)，其次为Me20/Em7(70.59%)、Me1/Em9(60.00%)；多态性比率最低的引物组合为Me6/Em29(12.50%)，总体而言，引物多态性比率较高。

多态性信息量(Polymorphism information content，PIC)是用来衡量不同引物对反应多态性高低的程度，20对引物组合的PIC为0.188~0.488，其中Me1/Em9扩增引物总条带数(15条)、多态性条带数(9条)以及PIC(0.387)均较高，该引物组合可以成为苦楝SRAP分子标记的骨干引物^[12]，20对引物的平均PIC为0.299，介于0.25~0.50之间，说明所选的SRAP引物可以很好地反映苦楝的遗传多样性^[13]。引物Me1/Em9的扩增图谱见图 1。

2.2 38个不同苦楝种源的聚类分析

根据SRAP标记分析结果，对苦楝38个种源间基于Nei’s的遗传距离进行UPGMA聚类分析，从聚类分析结果(图 2)可知，以0.350为阈值，38个种源可以分为7类，A04、A09、B01、B04、B06、C02、C03、C10、H03、H06、Z01为第1类，这一类主要分布在海南、广东、广西等地理位置偏南的地区，其中肯尼亚内罗毕的种源Z01也在这一类；B03、E02、E03、F01、F04、I01、J01、J02、K02为第2类，这一类主要分布在广东、福建、浙江、江苏东部沿海省份；E01、G01、G03、I02、J03、K01、L01、M02、P03、P04、U01为第3类，主要分布在湖南、湖北、陕西、河北等地；D01、D05、M01为第4类，主要为云南种源；Q01、Q02为第5类，来自甘肃。O01和C04各为一类，分别来自河南内乡和广西永福。

3 讨论

本试验从783对引物组合中筛选获得多态性较好的引物组合20对，这些引物组合多态性百分率平均为40.89%，PIC平均为0.299，说明SRAP分子标记可以较好地应用于苦楝的遗传多样性分析^[13]，并为充分开发、利用苦楝资源及完善苦楝遗传背景分析奠定基础。通过本试验开发出了多态性比率和PIC均较高的可用于苦楝SRAP分析的骨干引物(Me4/Em5、Me1/Em9)，可将大部分种源划分为准确的类型，为快速分析苦楝不同种源提供了方法。

根据SRAP标记分析结果，以0.350为阈值，可将38个苦楝种源划分为7类。其中，O01和C04各为一类，分别来自河南内乡和广西永福。由于这2类仅各含1个种源，代表性不强，为稳妥起见，河南内乡和广西永福暂不独立成类，将其余的36个种源，划分5个类群。苦楝种源类群划分有明显的地理趋势和气候生态特征。例如第1类群的种源来自海南、广东、广西等偏南省份，属于纬度较低，沿海地区的苦楝，这些地方水热条件充足。肯尼亚内罗毕种源聚在此类，这可能因为当地气候条件与我国两广、海南岛的气候更相似；第2类群种源主要分布在广东、福建、浙江、江苏东部沿海省份，其气温和降水量普遍低于第1类种源地；第3类群种源主要分布在湖南、湖北、陕西、河北等地，其气温和降水量低于第2类种源地；第4、5类群分别为云南、甘肃种源，两地区的气候差异很大，与前3类也有较大差异。

将该聚类结果与苦楝果核及种子性状做比对^[14]，果实主要表型特征为第1类的果实种子形态较小且质量较轻、棱粒较小；第2类的果实果核棱纹明显、果核单果棱数及粒数较少；第3类的果实种子较宽，果核形态近球形且棱纹不明显；第4类的果实种子形状较大且质量较重，果核皮较厚，果核单果棱数较多，但种粒数较少；第5类的果实果核和种子的质量及形态较大，核果皮较厚且棱纹较明显，果核单果棱数及粒数较多。