黄梁木Neolamarckia cadamba，又称团花树，为我国南方乡土阔叶树种，由于生长迅速，树干通直，因而被誉为“奇迹树”，早在20世纪70年代就受到国内外普遍关注。其材性与杉木相当，速生性与桉树、杨树相近，是较好的用材和纸浆原料树种；树皮含有丰富的生物碱类物质，其中3α-二氢卡丹宾和3β-二氢卡丹宾为治疗高血压药物“钩藤总碱”的有效成分，具有强而持久的降压作用，其效价已经接近利血平^[1]，这2个生物碱类物质在钩藤Uncaria rhynchophylla中仅为微量成分存在，而在黄梁木树皮中作为仅次于卡丹宾含量的主要成分存在，是较好的药源树种。此外，黄梁木也是优良的园林绿化、蜜源和饲料树种^[2]。黄梁木用途广，潜在经济价值大，有着广阔的开发前景。

因黄梁木有较好的速生、丰产特性，在云南、广西、广东和海南4省(区)，人工种植面积已达270 hm²，造林农户和企业积极性较高，种植面积仍有增大的势头。国内外学者已对黄梁木的种子生理^[3]和繁殖^[4-7]、引种驯化^[8-9]、病虫害^[10-11]、药用和化学成分^[12-14]、生物技术^{[7, 15-19]}、材性^[20]等进行了深入研究，从常规育种到分子育种及其基因功能研究等均取得较好的结果，但抗寒性相关的研究鲜见报道。本文以云南、广西和广东共7个1.5年生黄梁木种源的带芽枝条为材料，通过人工低温胁迫处理，采用隶属函数法和主成分分析法对不同种源抗寒能力进行综合评价，为黄梁木抗寒育种早期鉴定和引种栽培提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

从1.5年生实生苗植株剪取长度约为20 cm的带芽枝条作为试验材料，景洪、德宏、保山为云南种源，天河、云浮为广东种源，龙州、兴宁为广西种源。各种源来源情况详见表 1。种子均采集于10年以上树龄大树；种子播种后，苗高约20 cm时移植到施有20 kg农家肥的种植穴内，按需浇水，1年后开始在根部追施复合肥。种植地位于广东省增城市华南农业大学科研基地，地理位置E 113°37′，N 23°14′，海拔20.3 m，平均气温21.8 ℃，年均降水量2 137 mm；土质为黏壤土，地势平坦。

1.2 试验方法 1.2.1 低温胁迫处理

据黄梁木适生地气象记录、实地调查受寒害情况和低温胁迫预试验，低温胁迫处理梯度设置为8、4、2、0、-2、-4、-6和-8 ℃。以不做低温胁迫处理的材料作为对照(CK)。

于2013年12月中下旬(气温12~15 ℃)，随机剪取同一种源黄梁木植株中上部朝向和着生部位一致、长势旺、无病虫害的枝条，清洗表面脏物，吸干水分，每种源枝条剪取540根，分成6等份，作为每个生理指标测定和恢复生长材料，即每个处理30根，3次重复。其中，0 ℃以上低温不做预处理，直接置于人工气候箱中进行低温胁迫处理12 h；0 ℃及以下低温胁迫处理，先置于4 ℃下处理2 h，再将温度降至相应的低温处理12 h。在低温胁迫处理结束后，均在12 ℃中恢复12 h。试验处理中的升、降温速度均为2 ℃·h^-1。

1.2.2 测定指标

相对电导率(REC)、游离脯氨酸(用磺基水杨酸法)按王晶英^[21]的方法测定，丙二醛(硫代巴比妥酸显色法)、可溶性糖含量(蒽酮比色法)、可溶性蛋白质含量(考马斯亮蓝G-250染色法)按李合生^[22]的方法测定。

1.2.3 恢复生长试验

将低温胁迫处理后的带芽枝条，于25 ℃、光照强度2 500~3 000 lx、光周期12 h的条件下水培，每2天更换1次清水(每周用含MS大量元素成分的营养液培养2 d)，20 d后观察并记录枝芽萌发情况，统计存活率，以存活率高低作为衡量抗寒性强弱的指标^[23-26]。以长出嫩叶或芽点无褐化作为存活标准。

1.3 数据处理与分析方法 1.3.1 半致死温度计算

参照朱根海等^[27]和盖钧镒^[28]的方法，建立相对电导率拟合Logistic回归方程，计算半致死温度(LT₅₀)。Logistic回归方程为Y=K/(1+ae^-bt)，其中，Y代表胁迫处理温度下测得的相对电导率，K代表最大电导率(最大值为100)，a、b为方程参数，t代表低温胁迫处理温度。求该回归方程二阶、三阶导数，并令其为0，可得如下公式^[29-31]：

(1)

(2)

(3)

其中, t₁为回归曲线的拐点，即低温胁迫的半致死温度(LT₅₀)，t₂为组织细胞膜受伤的起始温度，t₃为组织细胞膜接近全透性时的温度。

按戴国俊等^[32]、董江水^[33]的方法，用SPSS 19.0软件估算方程参数，拟合方程，求出t₁、t₂和t₃。

1.3.2 抗寒性综合指标计算

用隶属函数法和主成分分析法进行综合评价^{[23, 25, 34-35]}。

若主成分因子负荷量为正，采用升型分布函数，隶属函数公式为：

(4)

若负荷量为负，则采用降型分布函数，隶属函数公式为：

(5)

其中，f(x_i)为各指标抗寒隶属度值，x_ij为j种源第i项指标测定值，x_imin、x_imax分别为第i项指标的最小值、最大值。

据各指标隶属函数值与各指标权重，通过加乘法则对各指标进行合成，计算抗寒性综合指数。计算公式为：

(6)

式中，I为抗寒性综合指数，W_i为抗寒指标的权重，f(x_ij)为各指标的隶属函数值。最后通过I值大小对不同种源的抗寒能力强弱进行评价。

数据方差分析、多重比较、相关分析和聚类分析等均用SPSS 19.0软件完成。作图用Excel 2003软件完成。

2 结果与分析 2.1 不同种源枝芽在低温胁迫下相对电导率的变化及细胞膜受伤温度的确定

从图 1可以看出，各种源在胁迫处理8~-8 ℃间，相对电导率的变化曲线基本呈“S”型，并且均在0~-4 ℃间变化较大。兴宁、云浮和天河种源在0~-4 ℃间的增加幅度略小，分别为28.16%、32.57%和34.06%，而保山和景宏种源的增加幅度较高，分别为46.43%和41.70%。在CK以及8~2 ℃低温间的变化曲线均近似于水平线，不同种源在相同低温处理下、同一种源在不同低温胁迫处理下的相对电导率变化较小；在胁迫温度小于-6 ℃后，各种源相对电导率变化减缓，并逐渐接近各自的最大值，表明细胞膜已接近完全受破坏。

相对电导率拟合的Logistic方程和细胞膜受伤温度见表 2。从表 2中可以看出，Logistic方程的决定系数R²为0.940~0.961，说明方程拟合度较好。不同种源的LT₅₀为-0.74~-2.11 ℃，最高为德宏(-0.74 ℃)，最低为云浮(-2.11 ℃)。云南3个种源的细胞膜受伤起始温度和死亡温度均为最高，分别为-0.20~-0.27和-2.78~-3.78 ℃；而广东、广西种源的细胞膜受伤起始温度和死亡温度明显低于云南种源：广东种源分别为-0.51~-0.57和-7.15~-7.89 ℃，广西种源分别为-0.49~-0.53和-6.83~-7.34 ℃。在所有种源中，云浮种源细胞膜受伤起始温度和死亡温度均最低，而德宏种源均最高。

因此，从相对电导率拟合方程推导出的膜受伤温度看，抗寒性由弱到强的种源应依次为德宏、景洪、保山、兴宁、天河、龙州、云浮。

2.2 低温胁迫对不同种源恢复生长的影响

不同低温胁迫处理下，黄梁木枝芽的存活率差异见表 3。当胁迫温度从0 ℃降至-2 ℃，7个种源存活率均下降明显：云南3个种源枝芽的存活率从几乎不受寒害迅速降低到4.0%左右(均值为4.15%)，而广东和广西4个种源的枝芽存活率均从几乎不受寒害降低至30%~40%(均值分别为37.20%和36.38%)。在-2 ℃低温胁迫下，种源间存活率差异显著，景洪最低，为3.88%，云浮最高，为42.03%，广东和广西种源存活率均值分别是云南种源均值的8.96和8.76倍。当处理温度为-4 ℃时，云南3个种源几乎全部死亡，广东和广西4个种源仍有少量枝芽存活，云浮种源存活率最高，为8.17%；当处理温度为-6 ℃时，云南3个种源、龙州种源全部死亡，天河、兴宁和云浮种源均接近全部死亡，存活率分别为0.03%、0.02%和0.13%。这与用相对电导率拟合Logistic方程得出不同种源的半致死温度(LT₅₀)在-0.74~-2.11 ℃基本一致。

结果表明，各种源枝芽在低于0 ℃的胁迫温度下，存活率迅速下降，当胁迫温度降到-6 ℃时，几乎全部死亡；在不同胁迫温度下，云浮种源存活率均最高，表明云浮种源的抗寒能力最强。总体上看，广东种源的抗寒性较广西种源强，而云南种源最弱。

2.3 黄梁木抗寒性综合评价 2.3.1 抗寒综合评价中生理生化指标的选取

植物遭受寒害后，评价植物受害程度或能否存活最直观的方法是观察枝芽恢复萌芽的能力^[36]。从表 3可以看出，当胁迫温度低于-2 ℃后，枝芽的存活率极低，并且已有部分种源死亡。而经-2 ℃处理后，各种源枝芽的存活率均下降，并且种源间差异达显著水平，因此，可选取-2 ℃处理的枝芽存活率作为不同黄梁木种源抗寒性的衡量指标。在-2 ℃处理下的相对电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量以及半致死温度见表 4。

相关分析表明，枝芽存活率与丙二醛含量(0.897^**)、游离脯氨酸含量(0.876^**)、可溶性糖含量(0.912^**)极显著正相关，与相对电导率(-0.964^**)、半致死温度(-0.987^**)极显著负相关，而与可溶性蛋白质(0.721)的相关性不显著。说明丙二醛含量、游离脯氨酸含量、可溶性糖含量、相对电导率、半致死温度对黄梁木抗寒性影响较大，而可溶性蛋白质对其抗寒性影响相对稍小。因此，选取与枝芽存活率极显著相关的丙二醛含量、游离脯氨酸含量、可溶性糖含量、相对电导率、半致死温度作为抗寒性综合评价的指标。

2.3.2 抗寒指标权重确定

由于用单一生理和生化指标对抗寒性评价具有一定的片面性，而且不同生理生化指标之间的关系复杂，对抗寒性的重要性不同，因此，对选取的5个抗寒生理生化指标进行主成分分析。结果(表 5)表明，第1个主成分的特征根大于1，贡献率达86.54%，其他主成分的特征根均小于1，贡献率较小。故用第1个主成分就能够代表原5个生理生化指标变量的信息(即此主成分指标包含原5个抗寒指标86.54%的相关信息)。因此，以第1主成分分析各指标的负荷量，计算各指标对黄梁木抗寒性作用大小，确定权重W_i(表 6)。

由表 6可见，对黄梁木抗寒性影响最大的指标是LT₅₀，其次是相对电导率，然后依次为可溶性糖、丙二醛、游离脯氨酸。

2.3.3 抗寒指标的隶属度

鉴于抗寒指标的单位、性质各不相同，但各指标的变化具有连续性，因此对这些指标进行标准数量化后，按主成分因子负荷量，采用隶属度函数法确定隶属函数的升降顺序^[37]。丙二醛、游离脯氨酸、可溶性糖3个指标采用升型分布函数，相对电导率和LT₅₀则采用降型分布函数。不同种源抗寒性指标隶属度值见表 7。

2.3.4 抗寒性综合指数值

根据上述各指标的隶属度值和权重，通过式(6)计算抗寒性综合指数I(表 8)，综合指数越大，表示抗寒性越强。由表 8可知，不同种源抗寒性从强到弱依次为云浮、龙州、天河、兴宁、景洪、保山、德宏。

3 讨论与结论

不同种源黄梁木在低温胁迫处理后，相对电导率的变化趋势基本一致，均随着胁迫温度的降低呈“S”型曲线上升。相对电导率拟合的Logistic方程结果表明，试验种源的半致死温度在-0.74~-2.11 ℃间，云浮种源的半致死温度最低。种源间在-2 ℃低温处理下存活率差异显著，均在45%以下，表明大部分枝芽已受到严重的寒害，与2011年1月广东省新兴县的黄梁木人工林遭受-1.5 ℃低温造成枝芽和顶芽枯死的调查结果(另文发表)相近。

大量研究结果表明，植物抗寒生理变化过程是错综复杂的，孤立地用某一生理指标很难反映植物对寒冷的综合适应能力^[38]。在小麦Triticum aestivum^[39]、珍珠菜属Lysimachia植物^[35]、葡萄Vitisvinifera^[40-41]、蜡梅Chimonanthus praecox^[42]、翅荚木Zeniainsignis^[24]等的抗寒研究中已发现，利用单项抗寒生化或理化指标鉴定植物的抗寒性局限性很大。而在核桃Juglansregia^[43]、扁桃Amygdaluscommunis^[34]、早实品种的核桃^[44]、平欧杂交榛Coryusheterophylla×Coryusavellan^[23]等植物的抗寒性研究中，利用了多个抗寒生化或理化指标进行综合评价，获得较满意的效果。本文采用隶属函数法和主成分分析法，利用与恢复生长相关性较强的相对电导率、丙二醛、游离脯氨酸、可溶性糖含量和半致死温度等5个抗寒指标进行综合评价，根据主成分的负荷量确定各个指标对抗寒性作用的权重，结合隶属度函数建立综合评价体系。最后评判出7个黄梁木种源抗寒能力强弱依次为云浮、龙州、天河、兴宁、景洪、保山、德宏，与恢复生长的试验结果基本一致。抗寒能力总体呈现广东、广西种源较云南种源强。根据前期造林对比试验，并结合本研究低温胁迫试验，在广东省新兴县、肇庆市和广州市等最低温度为-1~1 ℃的地区营造黄梁木人工林，应采用广东和广西的种源，而在广东雷州和海南海口和三亚等最低温度在1 ℃以上的地区造林，则可采用云南景洪、保山、德宏等地的种源。

目前，国内外测定抗寒性的主要方法有全株冰冻测试法(WPFT)，电解质渗出率法(EL)，电阻抗图谱法(EIS)，叶绿素荧光法(CF)等，选择何种测定方法获得植物不同阶段抗寒性的准确信息，取决于植物组织类型和生理状况、研究目的以及已有的仪器设备^[45]。在评价黄梁木抗寒能力时，应考虑对抗寒性影响的不同理化指标，利用综合评价体系进行评价，最后才能得到不同黄梁木种源抗寒能力强弱的合理结论。