邻苯二酸酯类化合物(PAEs)又称钛酸酯，是大约30种化合物的总称，主要用作塑料的增塑剂，以增大塑料的可塑性和强度^[1]。邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是塑化剂的一种，工业上主要用于硝基漆和聚氯乙烯(PVC)塑料的生产，以增强产品的柔韧性。此外，DBP还用于生产防泡剂、乳胶黏合剂和纺织助剂等^[2]。塑化剂的大量生产和频繁应用，导致在人们的日常生活中塑化剂污染严重。据报道，中国南京市区的大气塑化剂污染中，DBP占到了58.7%^[3]。DBP是一种具有生殖毒性和遗传毒性的环境雌激素，具有雌激素的作用，致突变，对胎儿有毒性，对肌肉、骨骼、中枢神经系统有影响，能通过消化系统、呼吸系统和皮肤进入人体^[4]，对人体产生不同程度的危害作用。有研究发现，DBP的代谢产物MBP对大鼠具有胚胎毒性作用，导致胚胎生长缓慢，同时对胚胎有致畸作用^[5]。

早在1975年，DBP就被世界野生动物基金会列为具有内分泌紊乱作用的物质之一^[6]。DBP还被欧盟2005/84/EC指令限制使用于儿童玩具和用品中，在塑料中的含量不得超过0.1%。美国、加拿大、日本、韩国等多个国家也相继发布了与欧盟类似的法律和标准^[7]，我国也将其列为优先控制污染物黑名单^[8]。近年来爆发的”台湾塑化剂事件“和“白酒塑化剂事件”，让人们重新认识了作为包装材料添加剂的“塑化剂”，由此引发了对食品包装材料安全性能的高度关注^[9]。目前对塑化剂的检测方法主要为气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)等，但这些方法费时，仪器昂贵，需专业人士操作，样品前处理复杂，不能同时大量分析^[10]。本研究采用的免疫分析技术具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点^[11]。

小分子物质邻苯二甲酸二丁酯只有反应原性，没有免疫原性，不能刺激动物发生免疫反应。为了获得具有免疫原性的完全抗原，必须将其与大分子载体进行偶联^[12]。本研究利用戊二酸酐合成了连接有5个碳臂长的半抗原衍生物4-戊二酸单酰邻苯二甲酸二丁酯(DBCP)，再通过活性酯法将DBCP与载体蛋白——牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶联获得人工抗原，最后利用间接酶联免疫法(icELISA)检测抗体。该抗原的合成为免疫分析技术的建立奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 材料与仪器

4-硝基邻苯二甲酸(质量分数≥99%)、钯碳：百灵威化学试剂有限公司；高纯氢气：广州市君多气体有限公司；二环乙基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清蛋白(BSA，质量分数为98.6%)、卵清蛋白(OVA，质量分数为98%)、弗氏完全佐剂与不完全佐剂：美国Sigma公司；SPF级雌性新西兰大白兔：广东省动物中心；羊抗兔IgG-HRP二抗：武汉博士德生物工程有限公司；其他试剂均为国产分析纯。TU-1901紫外-可见分光光度仪：北京谱析通用仪器有限责任公司；RT-2100C型酶标仪：雷杜生命科学股份有限公司；96孔酶标板：厦门云鹏科技有限公司。

1.2 人工抗原的合成与鉴定 1.2.1 4-硝基邻苯二甲酸二丁酯(DBNP)的合成

按照文献[13]中的方法，称取20 g(0.095 mol)4-硝基邻苯二甲酸，加入26 mL正丁醇，搅拌下加入3.3 mL浓H₂SO₄催化，120 ℃搅拌回流7 h后，蒸馏除去未反应的丁醇和生成的水。趁热导入冰水中，油状粗品用质量分数为10%Na₂CO₃洗涤至水层无色(pH7~8)后，分离出油状物，用无水乙醇溶解除去不溶物，加热后除去少量乙醇，趁热置冰箱中冷却，得到黄色油状液体28.5 g，产率93%。

1.2.2 4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP)的合成

取2 g(6.19 mmol)4-硝基邻苯二甲酸二丁酯和0.4 g钯碳溶于15 mL甲醇，缓慢通入H₂，50 ℃条件下回流搅拌反应5 h，反应结束后过滤，上清液旋转蒸发浓缩，用乙酸乙酯溶解后再过滤，旋转蒸发浓缩后得淡黄色固体1.78 g，产率98%。产物经硅胶柱层析提纯，通过氢核磁共振(¹H NMR)和质谱(MS)鉴定。

1.2.3 4-戊二酸单酰邻苯二甲酸二丁酯(DBCP)的合成

将0.29 g(1 mmol)DBAP和0.22 g(2 mmol)戊二酸酐溶解在20 mL四氢呋喃(THF)中，60 ℃条件下回流搅拌反应8 h，再转移至室温搅拌反应12 h，蒸馏除去THF。残余物溶于10 mL乙酸乙酯中，并用10 mL双蒸水洗涤，分离出乙酸乙酯层，转旋蒸发除去乙酸乙酯，得到黄色油状液体0.31 g，产率75%。

1.2.4 人工抗原的合成

将40.7 mg(0.1 mmol)DBCP，17 mg(0.15 mmol)NHS完全溶于1 mL的二甲基甲酰胺(DMF)后，加入31 mg(0.15 mmol)DCC，4 ℃条件下反应12 h，离心分离出上清液。取900 μL得到的上清液，滴加到8 mL溶有113 mg BSA的磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.4)中，4 ℃条件下反应12 h。10 000 g·min^-1条件下离心10 min。将上清液装入透析袋，用PBS透析3 d，每12 h换液1次，得到棕黄色的邻苯二甲酸全抗原溶液。

1.2.5 人工抗原的鉴定

为鉴定半抗原与载体蛋白是否偶联成功，分别将半抗原、载体蛋白和偶联物稀释至一定浓度进行SDS-PAGE鉴定，并在200~400 nm波长间进行紫外吸收光谱测定，以紫外分光光度法估算偶联物的结合比^[14]。

1.3 免疫动物及抗血清检测

以DBCP-BSA作免疫原，用PBS溶液(pH 7.4)稀释至1 mg·mL^-1，与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，对2只成年健康雌性新西兰大白兔采用背部多点注射和肌肉注射。3周后再次免疫改用等量的弗氏不完全佐剂进行乳化，以后每隔2周免疫1次，免疫后7~8 d耳缘静脉取血^[15]。

以DBCP-OVA作包被原，将抗血清用PBS溶液倍比稀释，采用间接ELISA法检测抗体效价，并用间接竞争ELISA法^[16]检测抗体的特异性。以标准品DBP浓度的自然对数值为横坐标，D/D₀(D、D₀分别为加兔抗血清和阴性血清对应的光密度)为纵坐标，建立竞争抑制曲线。

1.4 抗体特异性分析

采用icELISA法分别检测邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸单苄酯(MBzP)、4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)与抗体的交叉反应，并计算各竞争物的半抑制率(IC₅₀)，比较抗体对它们的亲和性。根据以下公式计算各竞争物与DBP抗体的交叉反应率^[17]。

2 结果与分析 2.1 半抗原衍生物合成结果分析

对半抗原衍生物4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP)和4-戊二酸单酰邻苯二甲酸二丁酯(DBCP)进行了质谱(MS)与氢核磁共振(¹H NMR)扫描，结果(图 1和图 2)表明合成成功。

由图 1a分析可知，DBAP的¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7.71 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.76~6.65 (m, 2H), 4.27 (dt, J = 17.6, 6.7 Hz, 4H), 1.78 ~1.61 (m, 4H), 1.52~1.37 (m, 4H), 0.96 (t, J = 7.3 Hz, 6H)，其MS图(图 1b)中293.9是M+H⁺，315.9是M+Na⁺，331.9是M+K⁺，348.1是M+Na⁺+CH₃OH，609.1是2M+Na⁺。由此可知，该化合物的相对分子质量为293，与计算结果吻合。

由图 2a分析可知DBCP的¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 9.02 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.69 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.24 (td, J = 6.7, 3.2 Hz, 4H), 2.46 ~2.21 (m, 4H), 2.01 ~ 1.83 (m, 2H), 1.74~ 1.56 (m, 4H), 1.39 (dp, J = 14.4, 7.3 Hz, 4H), 0.92 (q, J = 7.3 Hz, 6H)，其MS图(图 2b)中，406.2是M-H⁺。由此可知，该化合物的相对分子质量为407.2，与计算结果吻合。

2.2 抗原的鉴定 2.2.1 紫外可见光吸收光谱鉴定

经紫外可见光分光光度计测定，得到载体蛋白、半抗原衍生物以及人工抗原的紫外扫描图(图 3)。从图 3中可以看出，DBCP在波长204、223和269 nm处出现特征吸收峰，载体蛋白BSA在波长202和280 nm处出现特征吸收峰，OVA在205和280 nm处出现特征吸收峰，而DBCP-BSA则在205和272 nm处有显著吸收峰，DBCP-OVA在203和269 nm处有显著吸收峰。由于DBCP的羧基与载体蛋白的氨基发生偶联，所以紫外光谱中特征峰发生改变，但同时具备半抗原和载体蛋白的吸收特征，间接说明半抗原和载体蛋白偶联成功^[18]。根据紫外分光光度法估算DBCP-BSA和DBCP-OVA的结合比分别为11:1和17:1。

2.2.2 SDS-PAGE鉴定

人工抗原及蛋白的SDS-PAGE结果见图 4。由图 4可知，人工抗原的迁移速率均比载体蛋白的迁移速率小，表明偶联产物的相对分子质量均比载体蛋白的相对分子质量大。其中，DBCP-OVA和OVA在电泳图中的区分效果较好，可能是OVA的相对分子质量较小、结合上的DBCP较多的缘故(结合比17:1)。电泳图表明半抗原衍生物与载体蛋白偶联成功。

2.3 抗血清检测

对兔子进行5次免疫后耳部静脉采血，经离心得到抗血清，利用间接ELISA法检测抗体效价，结果见表 1。从表 1可知，兔1和兔2抗血清效价均达到1:128 000。包被抗原DBCP-OVA经方阵滴定法确定最佳包被质量浓度为2 000 ng·mL^-1。以抗血清最高效价稀释倍数，利用icELISA法测定其半抑制率(IC₅₀)，竞争抑制曲线如图 5，可知兔1和兔2的IC₅₀分别为301和308 ng·mL^-1。

2.4 抗体特异性分析

采用icELISA法对邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸单苄酯等邻苯二甲酸结构类似物进行特异性检测，结果如表 2所示。从表 2中可以看出，除DBP和DBAP外，其他结构类似物的交叉反应率均小于4.3%。因此，表明DBCP-BSA免疫新西兰大白兔所获抗体建立的icELISA方法特异性良好。

3 讨论与结论

半抗原的设计、半抗原的修饰和人工抗原的合成是制备抗小分子化合物抗体、建立相应的免疫分析方法的重要过程。之前的研究中，邻苯二甲酸二丁酯人工抗原的研究多以4-氨基邻苯二甲酸二丁酯为半抗原通过重氮化法与载体蛋白偶联制备^{[3, 11, 13]}, 这种方法在半抗原制备过程中通常使用苯等有毒有机溶剂，不利于试验操作人员的健康。其次，重氮化法的操作有一定的危险性，且步骤比较繁琐。Wei等^[2]在其研究中曾经制备带4个碳链的邻苯二甲酸二丁酯人工抗原，但在其研究中主要将这种抗原作为包被原来使用，并未深入探究这种抗原的免疫活性。

本研究在DBAP的4位氨基上利用戊二酸酐在半抗原与载体之间连接了1条含5个碳的手臂链，充分暴露出了半抗原分子的特征结构，而且连接了5个碳手臂链，更有利于人工抗原表面突显半抗原的结构特征，以利于产生具有高特异性的抗体^[19]。利用H₂还原、钯碳作催化剂，大大缩短了反应时间，避免了使用有毒试剂苯，试验操作更安全更简便，也提高了反应产率。使用戊二酸酐反应与戊二醛法反应相比较，产物更稳定，副产物少，专一性更强，产率更高。因此，该抗原的合成为下一步建立免疫分析技术奠定了基础。

本试验使用戊二酸酐反应合成了半抗原衍生物，经质谱、氢核磁共振谱图鉴定，衍生物合成成功。采用活性酯法将半抗原衍生物与载体蛋白进行偶联，合成人工抗原，经紫外光谱、SDS-PAGE鉴定，偶联成功。所得抗体经icELISA法检测知其具有较高灵敏度和较好特异性，可用于邻苯二甲酸二丁酯含量的测定。