2016, Vol. 37
2. 吉林农业大学 农学院，吉林 长春 130118
2. Faculty of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
磷是植物和大部分农作物所需的大量营养元素之一，缺磷会明显抑制植物的生长[1]。不同物种对磷的需求量从10到100 kg·hm-2不等[2]。而土壤中磷易被转化为磷酸钙[Ca3(PO4)2]、磷酸铁(FePO4)和磷酸铝(AlPO4)等不溶性磷酸盐，造成土壤中可溶性磷的浓度通常仅为1 mg·L-1或更少[1-3]。因此，为了增加农作物产量与效益，过度施用磷肥已使我国大部分土壤处于富磷状态。
土壤中大多数溶磷菌(Phosphate solubilizing bacteria，PSB)能通过生成有机酸、嗜铁素、矿物酸、质子、腐殖质、CO2 和H2S等来释放可溶性磷[4]，有效提高土壤中植物可利用磷的含量，同时也可以减少化肥的使用[5]。有研究表明，由于微生物对各种根系信号传导和分泌模式有不同的应答，尤其是当植物处于磷胁迫状态下，微生物群落受不同植物种类的影响较大[6]。Kobus等[7]发现溶磷微生物在土壤中的数量受土壤物理结构、有机质含量、土壤类型、土壤肥力、耕作方式和措施等因素的影响。目前共有89种溶磷微生物被鉴定，其中27种真菌，58种细菌和4种放线菌。相较于真菌和放线菌，溶磷菌是溶磷微生物的主要种类[8]。
中国东北黑土区是重要的粮食生产基地，过去的20年由于土壤腐蚀和大量施肥，黑土中磷的总量日趋增加[9]，但磷的当季利用率仅有5.12%[10]。大豆Glycine max是该地区主要农作物之一，平均种植面积2010年已经增长到800万hm2[11]。因此，明确黑土区大豆根际溶磷菌的种类与溶磷特点，发现大豆专属生物菌肥的有效菌源，在降低农业生产成本及资源节约利用方面将有重要的意义。但关于东北黑土区溶磷菌的研究报道并不多见。本研究从吉林省地区大豆根际土壤中分离到4株优势PSB，命名为WJ1、WJ3、WJ5和WJ6，并对这4种菌株的溶磷和产酸特性进行分析比较。
1 材料与方法 1.1 土壤样品及培养基3种土壤样品均取自于中国东北吉林省地区(吉林农业大学大豆试验田，长春市农安县大豆试验地和吉林省公主岭大豆试验地)的大豆根际土壤。NBRIP液体生长培养基[12]配方为：10 g·L-1葡萄糖, 5 g·L-1MgCl2·6H2O，0.25 g·L-1MgSO4·7H2O，0.2 g·L-1KCl，0.1 g·L-1(NH4)2SO4和5.0 g·L-1Ca3(PO4)2作为磷源，pH 7。固体培养基需添加15 g·L-1琼脂。改良NBRIP培养基：pH 8，0.5 g·L-1蛋白胨代替0.1 g·L-1(NH4)2SO4。LB培养基配方为：10 g·L-1 NaCl，10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母膏。
1.2 PSB菌株的分离和鉴定为了从土壤中分离得到PSB，每份土样与无菌水按质量比1: 100混合摇床震荡1 h。然后将逐级稀释的上清液涂布NBRIP固体培养基。28 ℃培养2 d，有明显溶磷圈的菌落为PSB[13]。在NBRIP琼脂平板上进行3~4次的纯化培养。纯化后的菌株-70 ℃条件保存备用。
利用Vitek2 (bioMerieus, France)细菌自动分析系统和16S rDNA分子生物学技术进行菌株鉴定。分别提取WJ1、WJ3、WJ5和WJ6的总DNA，进行16S rDNA序列扩增，PCR所用引物分别对应于大肠埃希菌(GenBank序列号为J01859)的7~26位和1 512~ 1 491位[14]，上、下游引物序列分别为，5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′和5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR产物由上海生工生物工程股份有限公司进行测序。GenBank DNA数据库和BLAST程序查找同源序列。
1.3 96 h细菌溶磷量与生长量的测定菌株WJ1、WJ3、WJ5和WJ6分别接种在LB培养基中，当培养液细胞浓度为D600 nm =0.6时，按体积分数为0.5%接种于100 mL改良NBRIP培养基。连续培养96 h，每隔6 h取样，标准板计数法测定细胞数量，钼蓝比色法测定溶磷量。
1.4 细菌生长对培养基pH的影响利用甲基红显色反应检测细菌溶磷过程中改良NBRIP培养基pH的变化。溶磷菌的培养同“1.3”，每隔1 h取PSB菌液2 mL，与100 μL 0.5 g·L-1的甲基红指示剂混合以记录培养基的颜色。利用同样的方法将4个菌株的培养液分别接种到100 mL改良NBRIP培养基和LB培养基中，培养12 h，每隔2 h取菌液2 mL，利用pH计记录培养基的pH。
1.5 培养基初始pH对细菌生长的影响将LB液体培养基pH分别调至3、4、5、6、7、8、9，按上面所述方法向LB培养基中接入4株分离的菌株，每隔2 h取1次菌液，记录12 h内D600 nm的值。
1.6 PSB菌株有机酸的提取为了测定不同PSB菌株产有机酸种类，将WJ1、WJ3、WJ5和WJ6种子液(同“1.3”)接种到改良NBRIP培养基中培养24 h后，培养液6 000 r·min-1离心15 min。上清液用0.22 μm滤膜真空抽滤，通过转酯作用对样品进行甲酯化反应[15]。每个样品取5 mL滤液与9 mL甲醇-硫酸(体积比=10: 7)混合，60℃培养12 h，待培养液冷却后离心分离，将5 mL甲醇加入到离心后的上清液中，上清液合并转移到60 mL分液漏斗中，再加入1 mL饱和NaCl溶液、20 mL蒸馏水、5 mL二氯甲烷进行洗涤，剧烈振荡60 s后静置分层。将脱水后的二氯甲烷相在40 ℃水浴条件下利用氮气吹干，然后准确加入1 mL二氯甲烷。以未接种的培养基作对照。样品进行GC-MS分析。
1.7 PSB菌株有机酸的GC-MS分析Agilent 5975c ga系统装置购于美国Agilent公司, 采用3轴的HED-EM质谱检测系统。Agilent hp-35弹性石英毛细管柱为30 m×0.25 mm×0.25 μm，采用氦气为1.0 mL·min-1的恒速流动模式。柱箱程序升温，初始温度为80 ℃，保持2 min，然后以5 ℃·min-1的速率升温至280 ℃，保持15 min。通过与Wiley 7和NIST库匹配的质谱来鉴定成分。
1.8 统计分析采用Windows XP系统中DPS统计软件(12.01版)分析数据。
2 结果与分析 2.1 PSB菌株的分离与鉴定按照溶磷圈大小，从大豆根际土壤分离获得WJ1、WJ3、WJ5和WJ6共4株溶磷能力较强的菌株。各菌株16S rRNA基因序列利用GenBank DNA数据库进行BLAST同源性比较，结果表明：菌株WJ1(登录号KM975675)与Pseudomonas putida N-128 (登录号JN216880.1)的相似性为99%；菌株WJ3(登录号KM975676)与Enterobacter cloacae subsp. Cloacae ENHKU01 (登录号CP003737.1)的相似性为99%；菌株WJ5(登录号KM975677)与Ochrobacterum haematophilum ATCC49188 (登录号NR-074243.1)的相似性为98%；菌株WJ6(登录号KM975678)与Klebsiella pneumoniae 342 (登录号CP000964.1)的相似性为98%。结合Vitek 2自动分析系统结果，将菌株WJ1、WJ3、WJ5和WJ6分别鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.、肠杆菌Enterobacter sp.、苍白杆菌Ochrobacterum sp.和克雷伯菌Klebsiella sp.。
2.2 PSB菌株溶磷量与生长曲线的变化为了研究pH、生长量和溶磷量之间的关系，将4株溶磷菌接种到以Ca3(PO4)2为唯一磷源的改良NBRIP培养基中。由图 1可知，各菌株的溶磷量和细胞生长量有明显的关系，当菌株生长量达到最大值时，溶磷量也趋于最大。溶磷菌WJ1、WJ3、WJ5、WJ6经过6 h延滞期后，开始以对数形式增长，之后分别在42、36、30和30 h时达到稳定期，稳定期分别维持在42~60、36~48、30~54和30~54 h。液体培养基中释放的可溶性磷的量随时间的变化逐渐增长，4种PSB最大溶磷量分别为558、478、596和586 μg·mL-1。在最初的12 h时，WJ5的溶磷能力都低于其他菌株，24 h之后溶磷量明显高于WJ1和WJ3。
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图 1 不同溶磷菌在接菌96 h内溶磷量与生长曲线的变化 Figure 1 The growth of different PSB and the amounts of P released by the PSB within 96 h of inoculation |
PSB在溶解磷酸盐过程中能够产酸[16-17]。虽然磷酸盐溶解的机理仍有许多不明之处，但已有报道称有机酸的释放导致的pH下降可能与溶磷作用相关[18]。甲基红试验表明：加入指示剂后，各菌株的培养物都观察到一致的颜色变化趋势(图 2)：由黄色变为橙色，最后变为红色，但不同菌株菌液达到红色的时间明显不同。菌株WJ1、WJ3、WJ5、WJ6分别在4、3、8和2 h时开始变色，在6、17、13和4 h后保持红色不变。由图 3可知，在改良NBRIP培养基中，细菌的生长过程伴随明显的pH下降。在12 h内，菌株WJ1、WJ3、WJ6培养物的pH从开始的8降到3~5。12 h内相对应的LB液体培养基的pH略有下降，之后又恢复到最初的数值。菌株WJ5在LB培养基中培养，12 h内培养液pH略有下降，在改良NBRIP培养基中培养12 h后，与其他3株菌相比，培养液pH下降较小。
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图 2 不同溶磷菌的培养基在接菌18 h内的甲基红显色结果 Figure 2 The methyl red tests of acidification levels of media within 18 h of inoculating different PSB |
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图 3 不同溶磷菌在12 h内对改良NBRIP和LB培养基pH的影响 Figure 3 Changes in pH of modified NBRIP media and LB media within 12 h of incubating different PSB |
为了研究pH和细胞生长量之间的关系，在初始pH为3~9的LB培养基中对PSB的生长进行了观测。由图 4可知，各pH条件下，WJ1、WJ3、WJ5和WJ6的细胞生长趋势相似。培养基pH低于4时，各菌株生长量明显下降。pH为5的条件下，WJ1和WJ3的生长轻微减缓，而WJ5和WJ6仍正常生长。
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图 4 不同溶磷菌在不同初始pH LB培养基中的生长曲线 Figure 4 The growth curves of different PSB in LB media with different initial pH |
对4菌株24 h培养物中的有机化合物进行GC-MS分析。表 1显示，WJ1、WJ3、WJ5、WJ6菌株的培养滤液中分别检测到6、8、8和7种有机化合物，这些有机化合物中包含了不同种类的有机酸。其中，乙酰丙酸的相对含量最高，但其是对照中检测到的仅有的有机酸成分，因而不能认定乙酰丙酸为PSB菌株溶磷过程中产生的。2，2-二甲氧基丙酸是4种菌株培养滤液中另一种共有的成分，相对于检测到的化合物总量所占百分比分别为：1.52%、2.36%、4.04%和3.44%。WJ1、WJ3、WJ6培养滤液中α-酮戊二酸的相对含量较高，分别达到21.46%、26.53%和23.80%。此外，WJ3与WJ6还检测到3种相同的物质，包括bis- (methoxycarbony) ethoxyiminomethane、琥珀酸、柠檬酸。
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表 1 不同溶磷菌溶磷24 h培养物中的有机化合物相对含量1) Table 1 Relative contents of organic compounds secreted from different PSB during 24 h of culturation |
植物从土壤吸收磷的主要形式为磷酸根离子(H2PO4-和HPO42-)，但土壤中的大多数磷酸盐不易溶解[19]。多种细菌及真菌具有将不溶磷酸盐转化成植物可利用的磷的能力[20]。本研究中我们报道了从大豆根际土壤中分离到4种优势PSB株，分别鉴定为假单胞菌属(WJ1)、肠杆菌属(WJ3)、苍白杆菌属(WJ5)、克雷伯菌属(WJ6)PSB菌株。菌株WJ1、WJ3、WJ5和WJ6在以Ca3(PO4)2为唯一磷源的液体培养基中培养96 h，最大溶磷量均高于赵小蓉等[21]报道的溶磷菌的溶磷量。细菌WJ1、WJ3和WJ6已经被确认为有高效溶磷能力的溶磷微生物[22-23]，但苍白杆菌属的溶磷特性及机制报道较少。本试验研究结果表明WJ5是1株具有分泌有机酸、高耐酸性的溶磷菌株。
甲基红试验和pH测定结果表明：PSB溶磷过程中pH会不断下降，pH降低到一定值时溶磷量也不再增加，这与菌株Ps. fluorescens RAF15表现的规律基本一致[9]。GC-MS对培养基上清液中有机酸的测定结果证实，pH的下降是有机酸分泌的结果。PSB耐酸性的强弱决定了细胞数量，而当细胞数量较多、生长稳定期较长，则溶磷量较大。菌株WJ5和WJ6具有更好的耐酸性，且WJ5分泌酸比较晚，有利于菌体生长；菌株WJ6的生长表现出更长的稳定期。因此，WJ1、WJ3、WJ5和WJ6产酸对于溶磷是1个必要条件，但是不同PSB菌株的溶磷能力依赖于活细胞的数量和其耐酸性。
不同溶磷微生物有多种溶磷机制[19]，通过分泌有机酸实现溶磷仍是大多数溶磷菌株的主要机制[24]。柠檬酸、乙酸、苹果酸和琥珀酸是溶磷过程中共有的有机酸，在许多不同的PSB培养滤液中都能检测到[1, 17]，但溶磷真菌Penicillium sp.溶磷过程中没有发现有大量有机酸的产生[25]。一些研究者认为磷的分解不仅是由有机酸和质子的释放引起的，此过程还伴随着NH4+的同化作用[26]。本研究中GS-MS分析得出，4菌株在溶磷过程都伴随有机酸的产生，且种类不同。除去2, 2-二甲基氧丙酸为共有的有机酸外，WJ5中发现的2, 4-已二烯二羧酸，hepta-2, 4-dienoic acid和3-羟基葵酸鲜有报道。相对于其他菌株，WJ5中hepta-2, 4-dienoic acid的相对含量较高。WJ6的培养滤液中ethanedione, di-2-furanyl的相对含量较高，但比α-酮戊二酸的低。而且4个菌株产生有机酸的种类和比例差别较大，化合物的类型和相对含量表明由磷酸盐溶解诱导的代谢途径在4个菌株中不完全相同。
本试验从东北大豆根际土壤中分离获得4株溶磷菌株WJ1、WJ3、WJ5和WJ6，分别被鉴定为假单胞菌属、肠杆菌属、苍白杆菌属和克雷伯氏菌属。4株溶磷菌96 h内最大溶磷量分别为558、478、596和586 μg·mL-1。4个菌株均分泌有机酸，但有机酸种类不完全相同，有机酸的分泌造成培养基pH降低，pH低于4时，明显影响溶磷菌的数量，而菌体数量多，菌体在平台期维持的时间较长，溶磷量较大。
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