沉香为瑞香科Thymelaeaceae沉香属Aquilaria或拟沉香属Gyrinops包括19个树种在内的树体受伤(包括雷击、动物啃食、昆虫蛀干或其他微生物侵染)后所得的特殊的心材物质^[1]。沉香主要的活性化学成分为倍半萜、2-(2-苯乙基)色酮以及芳香族化合物，无论是国际上还是国内，在评判沉香质量时，常以3类化合物中的1种或几种化学物质为特征成分来分级^[2]。沉香药材对治疗肠胃病、心绞痛等疾病有特效，是中国、印度、日本、尼泊尔及东南亚各国的传统名贵药材^[3]。从结香木质部提取的芳香油，具有特殊香味，是高级香味产品的主要原材料。此外，沉香也是世界五大教公认的祭祀圣物^[4]。天然的沉香树，受到刺激而产生排异反应，形成沉香，是一个偶发的现象，而且需要经历一个漫长的过程。近年来，人们对沉香资源需求的增长和已有天然沉香的毁灭性采掘导致天然沉香资源已几近枯竭。为了保障沉香资源的合理和可持续利用，2004年开始，《濒危野生动植物种国际贸易公约》已将这19种结香树种列为Ⅱ级保护植物。

据统计，我国沉香树种植面积已达3 000万株^[5]，健康沉香树无法结香，且传统的人工造伤技术，远远不能满足社会的需求，人工促进结香技术的改进已势在必行。研究表明，沉香树受到损伤后，在伤口处会有真菌侵入树体，激发树体的防御体系，从而在真菌和树体内酶的作用下产生一些具有抑菌活性的次生代谢产物，这些次生代谢产物即为沉香^[6]。人工接菌促进结香的历史可以追溯到1929年，所使用的菌种为结香树体分离的内生真菌^[7]。研究表明，感染黄绿墨耳菌Melanotus flavolives的白木香木质部细胞，2个月后可以产生一种倍半萜类物质，即白木香醛^[8]。何梦玲等^[9]也运用此种真菌处理白木香继代培养小苗的离体侧根，表明离体根在真菌侵染胁迫下能重新合成色酮化合物。

多种真菌均可以促进沉香树体结香，但其促进效果在不同的生长环境下表现不尽相同^[10-11]。本研究中，利用已分离的20个真菌菌种，将其接种于广东惠州惠东境内的白木香Aquilaria sinensis树体中，通过比较不同菌种菌液促使树体产生沉香物质的化学成分差异，来评价各菌种的有效性，从而筛选出最适于本地白木香树体结香的菌种。

1 材料与方法 1.1 试验材料与试验地概况

试验材料为广东种源的7年生白木香，试验地位于广东省惠州市惠东县白盆珠镇莲花山，为花岗岩地质；南亚热带季风气候，年均气温22.0 ℃，年均日照2 038.9 h，≥10 ℃年积温7 947.9 ℃；年均降雨量1 935.7 mm；年均相对湿度80%，年蒸发量1 875 mm，常年基本无霜；土壤为山地红壤。不同真菌分离自已结香的白木香树体、树桩和根系，从分离的54株不同种菌株中，选择20种具有代表性或有研究表明其对结香有效的菌种，且涵盖几乎所有已报道的菌种(表 1)。目标树胸径约为9~10 cm，树高和冠幅无显著差异(表 1)，有利于不同真菌对白木香树体结香促进作用大小的检测。

1.2 试验方法

于2014年7月，用选取的20个真菌菌种进行结香试验。先把选出的菌种转接到装有500 mL已灭菌的马铃薯葡萄糖水(广东环凯生物科技有限公司)溶液的锥形瓶中，28 ℃条件下恒温培养5 d后，将其用单层医用纱布过滤到大树输液袋中备用。对照为无菌葡萄糖水，每个处理设3株重复，每个重复注入树体的真菌代谢液为500 mL。选取胸径约为9~10 cm的白木香树，在目标树距地面50 cm处部位钻孔，孔径为0.5 cm, 两孔相距10 cm, 且呈90 °交叉, 孔深6 cm。选择晴朗无风的天气，将菌液以最快的速度注入树干。2015年5月进行采样测定。

1.3 挥发油测定

3个重复的样品木材原盘磨成粉，合并混匀，过20目筛，于60 ℃条件下恒温干燥至恒质量。取样品约3 g置于150 mL锥形瓶中，加入体积分数为95%的乙醇100 mL，连接冷凝回流管，加热至沸腾，1 h后冷却蒸干，计算乙醇浸出物含量。

1.4 GC-MS分析

沉香挥发油成分分析采用气质联用仪(美国，安捷伦6890 N-5975I)。GS-MS条件：色谱柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；起始温度60 ℃，保持2 min后，以8 ℃·min^-1的速度升至280 ℃，并保持12 min；进样口温度250 ℃；进样量1 μL(不分流)；色谱-质谱接口温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电离方式EI；电子能量70 eV；载气He(体积分数为99.999%)；载气流速1 mL·min^-1；质量扫描范围35~450 AMU；溶剂延迟4 min。通过HPMSD化学工作站，采用峰面积归一化法计算各化学成分相对含量，再通过NIST和Willy标准质谱库，经人工谱图解析和计算机数据系统检索，同时与相关文献进行核对^{[2, 12-14]}，确认所测定的化合物成分。

1.5 数据处理

运用SPSS18.0进行数据的统计分析。

2 结果与分析 2.1 不同真菌对白木香树体乙醇浸出物含量的影响

不同种类真菌菌液对白木香树体结香质量的影响不同，乙醇浸出物质量分数大于10%的为经龙眼焦腐病菌Lasiodiplodia theobromae、斑点青霉Penicillium meleagrinum、黑绿木霉Trichoderma atroviride、拟康木霉T. koningiopsis、青霉病病原菌Pen. italicum、腐皮镰孢Fusarium solani、葡萄座腔菌Botryosphaeria rhodina菌液处理的目标树，这7种树体所得乙醇浸出物的质量分数分别为13.16%、11.38%、12.21%、11.04%、11.70%、14.03%和12.88%，符合《中国药典》(2010版)沉香入药的标准，分别为对照目标树(5.00%)的2.63、2.27、2.44、2.21、2.34、2.81和2.58倍。其他13种处理(F1、F2、F4、F5、F6、F7、F9、F10、F11、F12、F13、F16、F18)的乙醇浸出物质量分数均低于10%，但高于5%, 分别为8.88%、6.25%、9.04%、6.70%、7.85%、6.51%、5.76%、9.62%、9.41%、9.65%、7.89%、8.47%和7.40 %。

2.2 不同真菌对白木香树体挥发油化学成分的影响

7种有效促进白木香物质形成的真菌处理，其所侵染木质部挥发油成分如表 2所示，乙醇浸出物质量分数大于10%的7种有效真菌处理，其检出物中共含有倍半萜化合物21种，芳香族化合物12种，色酮化合物1种，脂肪酸和烷烃类及其他化合物36种。这7种有效真菌处理，都含有的化学成分包括：苯甲醛、苄基丙酮以及十八碳烷酸、邻苯二甲酸二异丁酯、棕榈酸、正二十烷、8-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、正二十四烷、二十六烷、二十七烷。其中小分子苯甲醛和苄基丙酮可能是其他倍半萜、芳香族和色酮物质的前体物质，有效真菌F3、F8、F14、F15、F17、F19和F20侵染树体所得2-(2-苯乙基)色酮类物质相对含量分别为0.82%、1.22%、1.89%、2.35%、5.75%、2.46%和3.15%。

由表 3可知，乙醇浸出物质量分数≥10%的7种不同真菌处理白木香树体挥发性成分中，F3、F8、F14、F15、F17、F19和F20菌种处理分别分离得54、69、84、94、61、49和45个峰，已鉴定物质峰个数分别占总气化物峰个数的50.00%、55.00%、52.00%、31.00%、50.82%和53.06%，说明白木香挥发油气化产物成分复杂。除F8处理树体的芳香族类化合物相对含量大于倍半萜外，其他处理树体化学成分相对含量从高到低依次为：脂肪酸+烷烃类、倍半萜类、芳香族类和2-(2-苯乙基)色酮类。F3、F8、F14、F15、F17、F19和F20菌种处理所得倍半萜类化合物是对照的16.32、12.71、15.19、15.01、12.77、16.19和15.55倍；芳香族类为对照处理的4.46、5.81、5.62、4.83、4.27、5.52和5.25倍，说明上述7种真菌处理能有效促进白木香活性成分的积累。

由表 3可知，F1、F2、F4、F9、F10、F11、F12、F13、F16和F18处理树体倍半萜类化合物仅为对照的1.76、2.17、8.50、1.44、2.08、3.77、3.07、4.76、0.57和0.65倍；芳香族类化合物则为对照的0.79~2.07倍；F1、F2、F4、F5、F6、F7、F9、F10、F11、F12、F13、F16和F18处理树体所得挥发油成分中，均未检测到2-(2-苯乙基)色酮类物质。对照挥发油成分中鉴定物质占总气化物相对含量的63.06%，含极少量倍半萜、芳香族类物质，不含色酮类物质，脂肪酸和烷烃类相对含量最高，倍半萜和芳香族类物质的相对含量之和仅为脂肪酸和烷烃类物质相对含量的0.04倍；而结香效果较佳的7种真菌处理树体倍半萜类、芳香族类和2-(2-苯乙基)色酮类成分相对含量之和依次为：21.57%、21.85%、24.02%、22.83%、23.49%、25.15%和24.84%，仅略低于其脂肪酸和烷烃类物质相对含量；结香欠佳的13种真菌处理树体挥发油成分中，已鉴定物质峰个数占气化物峰个数的25.00%~45.61%，倍半萜和芳香族类物质的相对含量之和为2.67%~7.88%，仅为脂肪酸和烷烃类物质相对含量的0.05~0.18倍，与对照相近。

3 讨论与结论

本试验采用的是输液法的通体结香技术，此技术系统原理在于：将沉香诱导剂滴注入沉香树干，使诱导剂混入树干液流，在蒸腾作用下扩散到整个树体，使树体受到胁迫产生沉香物质^[15]。要求所选目标树干形和冠幅须保持一致，才能保证所注入树干的菌液散布均匀，从而保证沉香数量和质量的一致。本试验中，所选目标树经方差分析得胸径、树高和冠幅均差异不显著，有利于检验各菌种的有效性。

根据《中国药典》(2010版)沉香入药标准，乙醇热浸法所得浸出物质量分数不低于10%。经龙眼焦腐病菌、斑点青霉、黑绿木霉、拟康氏木霉、青霉病病原菌、腐皮镰孢、葡萄座腔菌菌液处理的目标树，其浸出物质量分数在11%~15%，符合入药标准。其他真菌处理和对照处理的乙醇浸出物质量分数均低于10%。

经GC-MS分析，结香效果欠佳的13种真菌以及对照处理树体挥发油主要组成物为脂肪酸和烷烃类物质，不含色酮类物质，有效活性成分倍半萜类和芳香族类物质的相对含量之和仅为2.67%~7.88%。而上述7种真菌菌液处理树体提取的挥发油化学成分中倍半萜、2-(2-苯乙基)色酮和芳香族类物质相对含量之和分别为21.57%、21.85%、24.02%、22.83%、23.49%、25.15%和24.84%。多年来国内外沉香化学成分分析的研究表明，沉香所含活性物质高达150多种，但主要为倍半萜类、2-(2-苯乙基)色酮类和芳香族类物质^{[13-14, 16]}。对照目标树提取物成分包括相对含量0.75%的倍半萜和1.90%的芳香族类物质，是因为滴注葡萄糖水及钻孔伤害足以促使沉香树体产生少量的沉香物质，而且在沉香树木粉干燥过程中，由于存在一部分活的细胞，倍半萜和芳香族代谢途径可能被促发^[14]，而其他真菌不能有效促使白木香树体受胁迫而产生特定的次生代谢反应。研究表明：龙眼焦腐病菌注入4年生白木香树干，其GC-MS分析所得化学成分与天然沉香成份最为相近^[12]，且通过组培试验证实，这种真菌能够通过产生茉莉酸甲酯，而显著提高愈创木烯等倍半萜类物质的含量^[17]，与本试验中F3菌种试验结果一致；齐楠沉香A. agallocha经青霉菌菌液处理后，树干提取物含有沉香呋喃等倍半萜化合物^[18]，与本试验中斑点青霉和小孢拟盘多孢毛菌种效果相同；而运用木霉菌提取物来刺激马来沉香A. malaccensis悬浮体系，所得沉香物质最多，其提取物化学成分包括：β-桉叶醇、β-愈创木烯和别香橙烯环氧化物^[19]，与本试验黑绿木霉和拟康木霉菌种试验结果一致；高晓霞等^[20]研究表明，镰刀菌诱导白木香叶，促使沉香物质产生，这一过程可能与镰刀菌改变了白木香叶真菌种类有关。Mohamed等^[21]认为，马来沉香受物理伤害后产生沉香物质，是由于伤口处感染镰刀菌的结果，这与F20菌种试验结果相近；将葡萄座腔菌接种于离体的白木香树枝，可以产生倍半萜9-二甲基-2-(1-甲基亚乙基)-环癸醇，而本试验中未检测到这种倍半萜，可能是活体树干内封闭与离体树干环境开放的差异所致。本试验中，所有结香效果显著的白木香树体提取物中，均含有苄基丙酮，这也可能是其含有2-(2-苯乙基)色酮类物质的原因^[22]。

综上所述，20种待测菌种中，只有7种真菌能有效促进白木香树体沉香物质的形成，而其他13种效用不明显。本研究中不同菌种的表现，对进一步促进白木香结香菌种的筛选，有很重要的借鉴作用。本试验中，使用真菌种类复杂，还需对其代谢液化学成分进行分析，才能进一步揭示真菌对白木香树体结香的促发机理。

致谢:

衷心感谢陆俊坤博士提供试验菌种及惠州市鸿茂林业发展有限公司钟锦祥董事长供给试验所需白木香目标树和试验过程中给予的诸多帮助！