2017, Vol. 38
荞麦属于蓼科荞麦属Fagopyrum 1年生双子叶草本植物，是国际粮农组织公认的药食兼用粮种。中国是荞麦种植面积最大、产量最高的国家[1]，且主要分布在西部贫困山区，成为这些地区的主要杂粮和经济作物[2]。种子是荞麦的主要食用部分，荞麦种子中不仅富含人体所必需的蛋白质、淀粉、脂肪等大量元素，还含有丰富的膳食纤维、维生素、矿物质等微量元素，以及禾本科粮食作物所不具备的黄酮、类黄酮等重要的次生代谢物[3]，具有降三高、抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、增强免疫力等功效[4]。蛋白质是荞麦成熟种子中的重要组成物质之一，荞麦籽粒富含中、低分子量蛋白质，缺乏高分子量蛋白质组分[5]。荞麦种子蛋白质质量分数(w)平均为12.89%，不同种间差异很大：大粒组野生荞麦为14.92%、大粒组栽培荞麦为12.52%、小粒组荞麦为10.39%[3, 6-7]。按照蛋白溶解度的不同，荞麦中种子蛋白的成分可以分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4类，其中清蛋白的含量最高，占荞麦种子蛋白总含量的71.4%；球蛋白和谷蛋白次之，均占9.1%；醇溶蛋白的含量最少，占荞麦种子蛋白总含量的7.4%[8]。
对荞麦种子蛋白相关编码基因进行研究，有助于从分子水平上了解种子蛋白合成机制。灌浆期是种子营养物质积累的主要时期，研究该时期相关基因的表达情况对于鉴定荞麦中种子蛋白基因具有重要意义。通过对荞麦灌浆期种子全长cDNA文库的筛选和分析，共获得了1 106个有效EST序列，这些序列主要参与抗病、储藏蛋白等[9]。通过筛选基因组文库，获得了17个13S球蛋白基因[10]。本课题组前期完成了荞麦种子的转录组学分析（SRA登录号：DRP001013），从中鉴定到了3个表达水平较高的种子蛋白基因[13S球蛋白（13S Globulin）基因、11S球蛋白（11S Globulin）基因和谷蛋白（Glutelin）基因]，并获得这3个基因的全长、氨基酸序列和基因组序列。本研究通过生物信息学方法对这3个基因的结构、进化关系以及基因上游1 500 bp启动子进行了分析，并分析了3个基因在荞麦种子灌浆期的表达情况，为探讨荞麦种子发育过程分子机制提供理论依据，也为改善荞麦种子蛋白含量和组分提供了优异基因资源。
1 材料与方法 1.1 种子蛋白基因序列的获取和生物信息学分析从本课题组测序的荞麦基因组数据中获得3个基因(13S球蛋白基因、11S球蛋白基因和谷蛋白基因)的编码序列、氨基酸序列和基因组序列，利用NCBI中BLASTP对其进行注释，利用在线EXPASY（http://web.expasy.org/compute_pi/）预测蛋白的等电点和相对分子质量；利用GSGD2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）预测基因结构；13S球蛋白、11S球蛋白和谷蛋白的同源序列从NCBI中获得，用MEGA6构建系统进化树。根据基因组注释文件的位置信息，利用本地Perl程序从基因组中调取基因上游1 500 bp启动子序列，用PLANTCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)预测启动子区域的顺式作用元件。
1.2 材料种植和取样选择甜荞F. esculentum、苦荞F. tataricum和金荞F. cymosum代表品种各1份，即丰甜1号、米苦荞104和红心金荞，均种植于贵州师范大学荞麦产业技术研究中心试验基地，常规大田管理，分别于授粉后第5天（灌浆前期）、第10天（灌浆中期）和第20天（灌浆末期）取样，取回的样品在冰上剥壳，剔除差异较大的种子，严格控制种子的大小和时期，所有的样品保存于-80 ℃冰箱备用。
1.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）RNA提取采用Plus植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司, 北京)，具体操作按照说明书进行。用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计检测RNA浓度及质量，用10 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。按照PrimeScriptTM RT Reagent Kit (Perfect Real Time)(宝生物工程有限公司, 大连)说明书反转录合成cDNA。
利用Primer Premier 6.0软件，设计qRT-PCR引物。引物设计标准是：扩增长度50~250 bp，温度(60±2) ℃，引物长度20~22 bp，GC质量分数45%~55%[11]。13S球蛋白基因的上下游引物分别为5′-ACGCCATAACCAGTCCGATTGC-3′、5′-AAAC-GCTTCCTCGCCTTCTCCT-3′；11S球蛋白基因的上下游引物分别为5′-ACAGTGTGCTGGTGTTGCCTTC-3′、5′-TGGTGTTCATCCTGGAACTCGC-3′；谷蛋白基因的上下游引物分别为5′-GCATGGCATGGCTCTCAA-CTGT-3′、5′-GCACCAAGTCCAACCTCACCAA-3′。以荞麦Actin基因为内参（GenBank登录号：HQ398855.1），上下游引物分别为5′-ACCTTGCTGGAC-GTGACCTTAC-3′、5′-CCATCAGGAAGCTCATAGTTC-3′。
qRT-PCR的反应体系和程序按照SYBR® Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus, 宝生物工程有限公司, 大连)说明书进行，相对表达量用2-ΔΔCt计算[12]，数据统计和作图使用Originlab公司的Origin8.0进行(http://www.originlab.com/)。
2 结果与分析 2.1 种子蛋白基因的序列分析 2.1.1 13S球蛋白基因核酸序列长1 548 bp。基因结构分析（图 1）表明，该基因含有4个外显子（分别为334、284、510、420 bp）和3个内含子（分别为109、80、143 bp）。编码的蛋白序列全长515 aa，蛋白的等电点为5.69，相对分子质量为58 330（表 1）。将其与GenBank中荞麦和其他物种中的13S球蛋白构建进化树，结果（图 2）表明：13S球蛋白与苦荞中已报道的一个13S球蛋白（又名过敏蛋白，GenBank登录号：ABI32184.1）的亲缘关系最近，仅有6个氨基酸的不同（相似性98%），推测二者为同一个基因；荞麦属甜荞和苦荞中20个13S球蛋白聚在一起，它们的亲缘关系较其他物种中的13S球蛋白更近；甜菜Beta vulgaris、胡杨Populus euphratica和烟草Nicotiana sylvestris中的13S球蛋白聚为一类。
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图 1 3个种子蛋白基因的结构 Figure 1 Structures of three seed protein genes 图中蓝色箭头表示外显子，红色线条表示内含子。 |
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图 2 13S球蛋白基因编码蛋白质的进化关系 Figure 2 Evolutionary relationship of the protein sequences encoded by 13S globulin gene |
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表 1 3个种子蛋白基因的基本信息统计 Table 1 Information of three seed protein genes |
核酸序列长2 745 bp。基因结构分析（图 1）表明，该基因含有8个外显子（分别为95、148、249、85、390、251、1 191、336 bp）和7个内含子（分别为79、100、582、132、612、119、337 bp）。编码的蛋白序列全长914 aa，蛋白的等电点为5.87，相对分子质量为103 350（表 1）。将其与GenBank中其他物种中的11S球蛋白构建进化树，结果（图 3）表明：本研究中的11S球蛋白与欧洲慈姑Sagittaria sagittifolia（GenBank登录号：CAA70334.1) 和猕猴桃Actinidia chinensi（GenBank登录号：ABB77213.1）中的11S球蛋白亲缘关系最近（相似性45%）。
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图 3 11S球蛋白基因编码蛋白质的进化关系 Figure 3 Evolutionary relationship of the protein sequences encoded by 11S globulin gene |
核酸序列长1 068 bp。基因结构分析（图 1）表明，该基因含有3个外显子（分别为196、721、151 bp）和2个内含子（分别为623、82 bp）。编码的蛋白序列全长355 aa，蛋白的等电点为6.45，相对分子质量为37 890（表 1）。将其与GenBank中其他物种中的谷蛋白构建进化树（图 4），结果表明：荞麦谷蛋白与甜菜Beta vulgaris中B5型谷蛋白亲缘关系最近（GenBank登录号：XP_010683769.1，相似性81%）；荞麦、甜菜和拟南芥Arabidopsis lyrata 3个物种中的谷蛋白聚为一类，其他物种中谷蛋白聚为一类。
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图 4 谷蛋白基因编码蛋白质的进化关系 Figure 4 Evolutionary relationship of the protein sequences encoded by glutelin gene |
13S球蛋白基因启动子区域的顺式作用元件列于表 2。13S球蛋白基因的ATG上游含有21个真核生物转录起始所必需的TATA框[13]和5个控制转录频率的CAAT框[14]；在其ATG上游1 500 bp内含有5个响应生物和非生物胁迫的顺式作用元件，即4个厌氧响应元件（ARE）[14]和1个真菌激发元件（Box-W1）[15]，表明该基因可能响应低氧环境和受真菌诱导；13S球蛋白基因启动子区含有10个响应激素的元件，即4个脱落酸响应元件（3个ABRE和1个CE1）[13, 16]，4个茉莉酸甲酯响应元件（2个CGTCA-motif和2个TGACG-motif）[17]，2个水杨酸响应元件（TCA-element）[18]，表明该基因可能对脱落酸、茉莉酸甲酯和水杨酸3类激素有响应；13S球蛋白基因启动子区含有一个MYB转录因子的结合位点（MBS）[19]，表明MYB转录因子可能能够结合在该基因的启动子区域，诱导它的表达；此外，还含有6个胚乳表达所需要的顺式作用元件（Skn-1_motif）[20]，表明该基因可能在胚乳中优势表达。
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表 2 13S球蛋白基因和11S球蛋白基因的启动子分析 Table 2 Promoter analysis of the 13S globulin gene and 11S globulin gene |
11S球蛋白基因启动子区域的顺式作用元件列于表 2。11S球蛋白基因的ATG上游含有2个真核生物转录起始所必需的TATA框[13]和8个控制转录频率的CAAT框[14]；在其ATG上游1 500 bp内含有5个响应非生物胁迫的顺式作用元件，即1个伤害响应元件（WUN-motif）[18]、1个热胁迫响应元件（HSE）[21]、2个低温响应元件（LTR）[22]和1个防御和胁迫响应元件（TC-rich repeat）[23]，表明该基因可能对伤害、高温、低温等非生物胁迫有响应；11S球蛋白基因启动子区含有7个响应激素的元件，即1个脱落酸响应元件（ABRE）[13]、2个茉莉酸甲酯响应元件（1个CGTCA-motif和1个TGACG-motif）[17]、2个水杨酸响应元件（TCA-element）[18]和2个生长素响应元件（TGA-element）[18]，表明该基因可能对脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸和生长素4类激素有响应；此外，还含有3个胚乳表达所需要的顺式作用元件（Skn-1_motif）[20]，表明该基因可能在胚乳中表达。
2.2.3 谷蛋白基因启动子谷蛋白基因启动子区域的顺式作用元件列于表 3。谷蛋白基因的ATG上游含有38个真核生物转录起始所必需的TATA框[13]和10个控制转录频率的CAAT框[14]；在其ATG上游1 500 bp内含有3个响应非生物胁迫的顺式作用元件，即1个热胁迫响应元件HSE[21]和2个防御和胁迫响应元件（TC-rich repeat）[23]，表明该基因可能对高温等非生物学胁迫有响应；11S球蛋白基因启动子区含有8个响应激素的元件，即2个脱落酸响应元件（ABRE）[13]、2个茉莉酸甲酯响应元件（1个CGTCA-motif和1个TGACG-motif）[17]、2个乙烯响应元件（ERE）[24]和1个赤霉素响应元件（GARE-motif）[18]，1个水杨酸响应元件（TCA-element）[18]，表明该基因可能对脱落酸、茉莉酸甲酯、乙烯、赤霉素和水杨酸等5类激素有响应；谷蛋白基因启动子区含有1个参与黄酮合成的MYB转录因子结合位点（MBSII）[25]，表明这一类的MYB转录因子可能能够结合到该基因启动子区域，诱导它表达。此外，还含有2个胚乳表达所需的顺式作用元件（1个Skn-1_motif和1个GCN4_motif）[20, 26]，表明该基因可能在胚乳中表达。
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表 3 谷蛋白基因的启动子分析 Table 3 Promoter analysis of the glutelin gene |
3个种子蛋白基因在甜荞、苦荞和金荞种子不同发育时期的表达情况如图 5所示：1）13S球蛋白基因在苦荞中的表达量最高，在金荞中次之，在甜荞中最低；在甜荞种子发育过程中，该基因的表达没有明显的变化，表明该基因在这一过程不起主要作用；在苦荞种子发育过程中，该基因在灌浆前期表达量较低，然后逐渐升高，到灌浆中期表达量最高，随后逐渐降低，表现出低-高-次高的规律；在金荞种子发育过程中，该基因的表达随着种子灌浆过程逐渐升高，表现出递增的规律（图 5A）。2）11S球蛋白基因在苦荞中表达量最高，在甜荞中次之，在金荞中最低；在甜荞种子发育过程中，该基因在灌浆前期和中期无明显表达，在灌浆末期大量表达，表现出低-低-高的规律；在苦荞种子发育过程中，该基因在灌浆前期低丰度表达，然后逐渐升高，到灌浆中期表达量最高，随后逐渐降低，表现出低-高-次高的规律；在金荞种子发育过程中，该基因的表达没有明显的变化，表明该基因在这一过程中不起主要作用（图 5B）。3）谷蛋白基因在甜荞中的表达量最高，在苦荞中次之，在金荞中最低；在甜荞种子发育过程中，该基因在灌浆前期有一定的表达，随灌浆进程表达量逐渐升高，在灌浆中期最高，随后快速下降，在灌浆末期表达量最低，表现出中-高-低的规律；在苦荞种子发育过程中，该基因的表达与在甜荞种子发育过程中一致，也表现出中-高-低的规律；在金荞种子发育过程中，该基因在灌浆前期的表达量最高，随后逐渐降低，表现出递减的规律（图 5C）。
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图 5 种子蛋白基因在荞麦种子发育过程中的表达 Figure 5 Expression patterns of three seed protein genes in the process of seed development *表示相同时间与甜荞种子相比，差异达到极显著水平（P＜0.01，Bonferroni法）。 |
蛋白质是荞麦种子中的重要营养物质之一，按照蛋白溶解度的不同，荞麦中种子蛋白的成分可以分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4类。目前荞麦中球蛋白的编码基因已经鉴定了19个，均为13S球蛋白基因（18个来自甜荞、1个来自苦荞）[10, 27]。本研究获得的球蛋白基因与苦荞中已报道的一个球蛋白基因（GenBank登录号：ABI32184.1）十分相似，在氨基酸水平上仅有6个氨基酸的不同，推测二者为同一个基因；将ABI32184.1在细菌中表达，重组蛋白的大小为65 400，通过EXPASY对本研究中获得的13S球蛋白进行预测，其相对分子质量为58 330，二者差异较小，说明通过EXPASY预测的蛋白相对分子质量比较可靠，具有一定的参考价值[27]。荞麦中11S球蛋白、清蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的编码基因目前鲜见报道，本研究获得了1个11S球蛋白和1个谷蛋白的基因序列，这为后续进一步研究基因功能奠定了基础。
通过对3个种子蛋白基因上游启动子序列的分析，挖掘了许多响应胁迫和激素及胚乳表达所必需的顺式作用元件。植物的生长发育除了遗传调控外，还会受到环境的干扰，恶劣环境会对植物的生长发育产生不良影响，如高温、冻害、损伤、缺氧、病原菌侵染等[28]。植物为了避免环境因素导致的不良影响，会诱导相关基因的大量表达，来抵制或消除这些不良环境造成的弊端，维持植物正常的生长发育[29]。3个种子蛋白基因的启动子区域都有响应胁迫的顺式作用元件，表明这3个基因可能在荞麦种子灌浆过程中参与到对各种胁迫的响应中，从而维持种子正常的生长发育过程。植物激素的作用主要有2个：一个是响应植物的逆境胁迫；另一个是植物某一生长发育过程所必需[30]。茉莉酸甲酯主要参与植物的抗逆和衰老过程，水杨酸主要参与植物的抗逆过程，脱落酸主要参与植物的干旱胁迫和种子萌发过程，生长素主要促进植物的生长发育，乙烯促进植物的衰老和成熟，赤霉素则促进植物的生长发育及开花过程[31]。在本研究3个种子蛋白基因的启动子中发现了这几类激素的响应元件，表明这些基因可能是这些激素作用的下游信号途径中的一员，与荞麦种子发育过程中对逆境的响应、营养物质的积累和种子成熟有关。水稻种子中的蛋白质主要积累在胚乳外周区域[32]，本研究的3个种子蛋白基因的启动子区域都含有胚乳表达所需的顺式作用元件（Skn-1_motif和GCN4_motif），这表明荞麦种子中蛋白质的积累部位可能和水稻相似，也在胚乳中。
在甜荞、苦荞和金荞种子发育过程中，这3个基因表达较高的时期均集中在灌浆中期，说明灌浆中期是种子蛋白积累的关键时期，这一发现与水稻中的结论一致[32]。3个基因在不同材料中的表达水平不一致，13S球蛋白基因在苦荞和金荞中表达量较高，11S球蛋白基因在甜荞和苦荞中表达量较高，谷蛋白基因则在3个材料中均有较高水平的表达，这说明不同材料中相关蛋白的编码基因并不是一致的，这些基因可能存在一定的冗余，当一个编码基因不表达时，则由其同源基因来代替它完成功能，从而完成种子的发育过程。
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