南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV）为呼肠孤病毒科Reovirides斐济病毒属Fijivirus^[1]。该病毒由迁飞性昆虫介体白背飞虱Sogatella furcifera传播^[2]，病毒可在虫体内增殖，虫体一旦获毒，可终身带毒^[3]。研究^[4]表明SRBSDV可侵染水稻Oryza sativa、玉米Zea mays、稗草Echinochloa crusgalli和白草Pennisernm flaccidum等多种禾本科植物。感染SRBSDV的水稻表现出植株矮缩、叶色深绿、节部气生须根倒生等典型症状^[5]。近年来，由于耕作制度的改变、气候变暖和白背飞虱暴发等多种因素的影响，SRBSDV在我国多个省市流行成灾。2009年，SRBSDV在江西、湖南和广东等部分地区严重发生，受害面积超过30万hm²，约6 500 hm²水稻绝收^[6-7]。2010年，SRBSDV在安徽省6市26县水稻种植区大发生，受灾面积约3.3万hm^2[8]。

SRBSDV病毒粒体为正二十面体等轴状粒子，直径70~75 nm，其基因组由10条dsRNA组成，分别命名为S1~S10，共编码13个蛋白^{[1, 9]}。根据水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)基因组结构推测SRBSDV共编码6个结构蛋白（S1、S2、S3、S4、S8、S10）和7个非结构蛋白（S5-1、S5-2、S6、S7-1、S7-2、S9-1、S9-2）^[10-12]。目前，仅有部分片段编码的蛋白功能得到注释，S1编码Rep蛋白，指导基因组RNA的复制；S4编码外壳蛋白的B型突起^[13]；S5-2编码的蛋白主要定位于细胞质，且能在细胞质中形成较大的颗粒状聚集体^[14]；S6编码1个RNA沉默抑制子，协助病毒克服寄主的防御体系，利于病毒的侵染^[15]；S7-1编码一种小管蛋白，与病毒的胞间移动有关^[10]；S8编码核心内衣壳蛋白，参与形态构建^[16]；S9-1编码蛋白与病毒基质的形成密切相关，是dsRNA合成及病毒组装的重要场所^[10]；S10编码外壳蛋白，决定了该病毒的表面抗原特性^[17]。

水稻叶片胶体金定位和本氏烟叶片亚细胞定位研究^[18]发现，RBSDV编码的13个蛋白中，仅S5-2编码的P5-2蛋白定位在叶绿体上，RBSDV侵染水稻表现的叶色深绿症状可能与P5-2蛋白有关，推测P5-2蛋白可能是RBSDV的症状决定子。SRBSDV S5-2基因编码的P5-2蛋白可能具有相似的功能，因此，本研究克隆SRBSDV安徽分离物S5片段序列，探究来源于安徽的SRBSDV S5片段与Fijivirus其他成员S5片段之间的序列差异；再进行原核表达获得P5-2融合蛋白，以期为深入研究P5-2蛋白的功能奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

感染SRBSDV的水稻样本于2012年8月采自安徽怀宁，样本保存于-80 ℃冰箱；大肠埃希菌Escherichia coli DH5α和BL21及原核表达载体pET-GST保存于安徽农业大学植物保护学院植物病理研究室；克隆载体pMD19-T、T4-DNA连接酶及DNA内切酶购自TaKaRa公司，硝酸纤维素膜购自北京索莱宝公司，Ni²⁺柱购自QiaGen公司；GST-Taq·Antibody单抗、AP·羊抗小鼠IgG二抗及异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）购自美国Amersham Pharmacia公司；DNA marker、蛋白marker、PCR凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自天根生化科技公司；Trizol^® Plus RNA Purification Kit购自北京全氏金生物科技有限公司；Taq DNA聚合酶、HiFi-MMV反转录试剂盒购自Promega公司；其余试验药品均购自国药生物公司。引物合成及测序为上海Invitrogen公司。

1.2 方法 1.2.1 SRBSDV S5片段的克隆与序列分析

称取0.1 g水稻感病样本，加液氮研磨，再用RNA抽提试剂盒提取水稻叶片总RNA，详细方法参照Trizol^® Plus RNA Purification Kit说明书。反转录水稻总RNA，得到cDNA。以cDNA为模板扩增S5片段，引物S5-F：5′-AAGTTTTTTTCACTCATGACATATTCGA-3′/S5-R：5′-GACATCAGCTGTATTCACTCC-3′，反应条件为94 ℃ 45 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 120 s，循环30次。用纯化的目的片断连接载体pMD19-T，热击转化DH5α，挑取单菌落为模板，PCR扩增筛选阳性转化子。根据测序结果获得SRBSDV S5片段核苷酸序列。运用软件DNAMAN Version 5.22和DNAStar进行序列分析。采用邻近相连法（Neighbor-joining）构建系统发育树。

1.2.2 SRBSDV S5-2基因的克隆及原核表达载体的构建

根据SRBSDV片段S5的核苷酸序列设计扩增引物，正向引物添加酶切位点BamH I，S5-2-F：5′-ACGGATCCATGTCTATGACACGTT-3′，反向引物添加酶切位点Sal I位点，S5-2-R：5′-CCGTCGACTCA-AACATGAAGTATA-3′。以含有S5片段的质粒DNA为模板，PCR扩增S5-2基因，反应条件为94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，循环30次。琼脂糖电泳纯化扩增的DNA目的片段，连接载体pMD19-T，热击转化DH5α，挑取单菌落PCR筛选阳性转化子pMD-S5-2。重组载体pMD-S5-2和表达载体pET-GST均用限制性内切酶BamH I和Sal I酶切，再将S5-2基因插入表达载体pET-GST，热击转化DH5α，挑取单菌落PCR筛选阳性转化子pET-S5-2。

1.2.3 融合蛋白的表达、纯化与检测

将获得的质粒pET-S5-2转化BL21，挑取阳性转化子接种于LB培养基，37 ℃条件下振荡培养12 h，再扩大培养至菌液D_{600 nm}= 0.6。诱导条件为28 ℃、10 h、0.2 mmoL·L^-1 IPTG。将培养好的菌液离心，收集菌体，在超声破碎仪内处理15 min，12 000 r·min^-1条件下，将破碎的菌液离心30 min；上清液转移至新的离心管，加入1 mL的镍胶亲和纯化琼脂糖（Ni²⁺-NTA），过柱纯化获得融合蛋白。

共设4个处理的菌液，空载体pET-GST未诱导、空载体pET-GST诱导、重组载体pET-S5-2未诱导和重组载体pET-S5-2诱导。各处理菌液用PBS缓冲液重新悬浮，混入5×Buffer，在沸水中处理5 min，再冰浴10 min；离心后，上清液转移到新的离心管，即为制备的上样样品。相同方法处理过柱纯化获得的融合蛋白制备上样样品。制备2块聚丙烯酰胺凝胶，同时电泳，第1块凝胶用考马斯亮蓝染色后观察蛋白条带，第2块凝胶用作Western blot分析，先覆盖NC膜进行转印，再将NC膜转移至50 g·L^-1奶粉溶液中，25 ℃轻微振荡处理2 h，加入稀释2 000倍的GST-Taq·Antibody单抗（一抗），25 ℃条件下振荡处理1 h，PBST溶液冲洗3次，再用稀释2 000倍的AP·羊抗小鼠IgG（二抗）振荡处理2 h，PBST溶液冲洗5次，最后加入NBT/BCIP显色。

2 结果与分析 2.1 SRBSDV S5片段的克隆与序列分析

将PCR扩增的SRBSDV安徽分离物（SRBSDV-AnHui-HN2）S5片段克隆并测序，序列长度为3 167 bp，序列的GenBank登录号为：HF954999。比对SRBSDV-AnHui-HN2 S5片段和NCBI下载的斐济病毒属（Fijivirus）其他分离物S5片段的序列相似性，发现SRBSDV-AnHui-HN2 S5片段与其他SRBSDV S5片段的序列相似性极高，达99.0%~99.7%，而与其他Fijivirus成员S5片段的序列相似性较低，仅为38.0%~71.3%（表 1）。

构建SRBSDV安徽分离物与Fijivirus其他成员S5核苷酸序列系统关系树（图 1），结果发现，SRBSDV和RBSDV聚成一个分支，其中6个SRBSDV分离物聚成一个亚分支，8个RBSDV分离物聚成另一个亚分支。而里奥夸尔托病毒（Mal de Rio Cuarto virus, MRCV）、稻飞虱呼肠孤病毒（Nilaparvata lugens reovirus, NLRV）和斐济病病毒（Fiji disease virus, FDV）分别单独聚成一个分支。

2.2 SRBSDV S5-2重组表达载体的构建

PCR扩增的模板为含有S5片段的质粒DNA，引物为S5-2-F和S5-2-R，只能扩增出1条约600 bp的条带，将此特异性条带克隆并测序，证明插入pMD19-T simple的S5-2基因没有发生变异。再将S5-2基因亚克隆到原核表达载体pET-GST上，BamH I和Sal I双酶切验证，片段大小和理论值完全相符（图 2），测序验证S5-2基因序列未发生突变，说明插入的S5-2基因读码框正确。

2.3 重组蛋白的诱导表达与纯化

从图 3a可以看出，pET-S5-2诱导表达的P5-2蛋白条带相对分子质量大约为47 000，与理论预测完全符合。从图 3b可以看出，GST-Taq·Antibody单抗可以和pET-S5-2诱导表达的P5-2融合蛋白以及纯化的P5-2融合蛋白特异性结合，在蛋白相对分子质量47 000的P5-2融合蛋白位置均出现一条明显的条带；而pET-GST空载体未诱导、pET-GST空载体诱导和pET-S5-2未诱导3个处理，各个泳道蛋白相对分子质量47 000位置均未出现条带。

3 讨论与结论

序列比对发现SRBSDV-AnHui-HN2与其他SRBSDV各分离物S5片段的序列相似性极高，说明SRBSDV S5片段核苷酸序列在序列进化过程中非常保守。系统关系树表明SRBSDV和RBSDV聚成一个分支，而NLRV、FDV和MRCV分别单独聚成一个分支。研究发现，SRBSDV和RBSDV同属于Fijivirus属亚组II，SRBSDV和RBSDV的血清学关系较强^[19]，均为害水稻和玉米，主要发病地区是东亚和东南亚，但SRBSDV的传播介体是白背飞虱，RBSDV的传播介体是灰飞虱Laodelphax striatellus^[2]。NLRV属于Fijivirus属亚组V，只能侵染褐飞虱Nilaparavata lugens，与Fijivirus属其他成员没有任何血清学关系^[20]。FDV属于Fijivirus属亚组I，传播介体是甘蔗扁角飞虱Perkinsiella spp.，自然寄主为甘蔗Saccharum officinarum，主要发病地区是澳大利亚，与Fijivirus属其他成员也没有任何血清学关系^[21]。MRCV虽属于Fijivirus属亚组II，但其传播介体是明飞虱Delphacodes kuscheli，主要寄主是玉米，也能侵染高粱Sorghum bicolor L.、小麦Triticum aestivum Linn.和燕麦Avena sativa L.等禾本科作物，一般发生于南美洲的阿根廷和巴西南部，与SRBSDV和RBSDV血清学关系均较弱^[22]。

张蔚明等^[17]制备的SRBSDV P10蛋白特异性抗血清，可用于带毒白背飞虱和感病水稻寄主的快速检测。羊健等^[16]原核表达了RBSDV P8蛋白并制备了P8蛋白的多抗血清，可用于RBSDV田间病株的快速诊断。张上林等^[23]原核表达了RBSDV P7-2蛋白，与水稻总蛋白进行了Pull-Down试验，鉴定出与P7-2互作的4个水稻蛋白。本研究利用载体pET-GST获得了带有6×His和GST双标签的P5-2融合蛋白，28 ℃、10 h和0.2 mmol·L^-1 IPTG条件下诱导，P5-2蛋白能够快速、大量地表达，但表达的P5-2蛋白为沉淀蛋白，缺乏生物活性，可用于抗血清制备，但不能进行蛋白互作试验^[24]。为了获得具有生物活性的可溶性蛋白，需降低诱导温度，延长诱导时间，调整IPTG诱导浓度等优化诱导条件，提高可溶性蛋白的表达量，为开展Pull-down和Co-IP等蛋白互作试验奠定基础。