2017, Vol. 38
肌纤维是肌肉的基本单位。不同类型肌纤维的收缩、代谢等特性不同，其主要是由肌纤维的生长发育及肌纤维类型的相互转化决定，该因素进一步导致不同类型肌纤维组成的肌肉的差异，最终影响肌肉品质[1]。肌纤维性状受到遗传物质基础和营养环境的共同影响，最终决定子代早期生长发育乃至成年期的表型。研究家兔Oryctolagus cuniculus发育早期与肌肉生长相关基因的表达规律及相关性有助于了解家兔肌纤维形成的分子机制。新西兰白兔是从国外引进的优良肉兔品种，其肉用性能在经过多代选育后得到了提高，具有生长速度快、饲料报酬高、屠宰性能好和适应性较强等优点，同时还作为理想的试验动物，广泛应用于医药学、生物学领域。本研究以新西兰白兔为试验素材，利用冰冻切片技术分析不同周龄背腿肌中肌纤维性状，探明其不同发育阶段肌肉组织结构之间的差异，为优质肉兔品种资源的保护、开发和利用提供参考依据。
在前期研究中，我们利用基因芯片筛选技术发现的Myh6基因与肌肉的生长发育密切相关。付睿琦[2]通过蛋白质组学技术筛选北京油鸡肌肉发育相关基因，发现Myh6基因可能参与肌肉细胞骨架结构。斑马鱼wea突变体由于干扰了斑马鱼Myh6基因的正常表达导致了心房收缩缺陷[3]；射血分数降低的左心房发育不良也与Myh6隐性突变有关[4]；Myh6的变异能引起病态窦房结综合征[5]。Myh6是肌球蛋白重链基因家族的一员，但是该基因家族对骨骼肌影响的研究鲜见报道。本研究采用实时荧光定量PCR技术分析Myh6基因在不同周龄背腿肌中的表达水平，并针对新西兰白兔不同周龄不同类型肌纤维性状与Myh6基因的表达水平进行相关性分析，以揭示Myh6基因在新西兰白兔肌肉发育过程中作用，为家兔肉品质的改良提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物新西兰白兔由江苏省南京市金陵总兔场提供，在相同环境条件下饲养，分别于2、4、6、8、10、12周龄时屠宰，每个周龄公母兔各取15只，取背最长肌(以下简称背肌)和后腿内侧肌肉(即股四头肌，以下简称腿肌)适当大小各2块，一块用于冰冻切片制作，另一块用于总RNA提取。
1.2 组织学测定取出样品，修块，放入冰冻切片机的快速冷冻架上，进行切片，切片厚度5~10 μm。把切片样贴于载玻片上，染色，封片，显微镜观察，取平均值±标准误用于结果分析。
1.3 RNA提取及cDNA制备采用Trizol法提取肌肉组织总RNA。再使用Super RT cDNA Kit(购于北京康为世纪生物科技有限公司)制备cDNA样品，置于-20℃冰箱中保存备用。
1.4 引物设计及合成根据GenBank公布的家兔基因的mRNA序列(NC_013685.1)，利用NCBI网站Primer-BLAST在线引物设计程序设计得到了Myh6基因的荧光定量引物和内参基因GAPDH引物序列，由上海生工生物有限公司合成。引物信息见表 1。
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表 1 引物信息 Table 1 Primer information |
利用染料法(SYBR GreenI)进行实时荧光定量PCR分析，预混体系购于北京康为世纪生物科技有限公司，根据说明书优化反应体系后，于冰上配制反应体系。每个样品设置3个重复，利用ABI7500荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，USA)分析PCR过程中荧光信号值的变化，并获取到各样品基因的Ct值，用GAPDH基因作为内参对表达水平均一化处理，并通过ΔΔCt方法来计算基因表达的差异倍数。
1.6 数据分析相对定量的结果采用2-ΔΔCt法进行分析。运用SPSS软件中Pearson Correlation分析Myh6基因表达和肌纤维性状的相关性，数据图采用平均值±标准误。
2 结果与分析 2.1 冰冻切片新西兰白兔2、4、6、8、10和12周龄背腿肌采用冰冻切片制片后，经琥珀酸脱氢酶染色法染色，根据染色的深浅判断不同的肌纤维类型。如图 1所示，染色最深呈蓝紫色的为红肌纤维，染色最浅的为白肌纤维，染色中等的为中间型肌纤维。研究结果表明，新西兰白兔2、4、6、8、10和12周龄公母兔的背肌和腿肌均具有红肌纤维、白肌纤维和中间型肌纤维3种肌纤维类型。
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图 1 新西兰白兔公母兔背肌和腿肌的冰冻切片结果(8周龄) Figure 1 Frozen section examination of back muscle and leg muscle of New Zealand white rabbits (8-week-old) A:公兔背肌; B:公兔腿肌; C:母兔背肌; D:母兔腿肌。 |
肌纤维密度和面积是重要的肌纤维性状之一。肌纤维密度与肌纤维面积成反比例关系，即肌纤维面积越大，密度越小；肌纤维面积越小，密度越大。不同周龄新西兰白兔肌纤维密度和面积统计结果如图 2所示，各类肌纤维的密度随着周龄数的增加而变小，2~8周龄，这种变小的趋势很明显，8~12周龄，趋势越来越小，几乎保持不变。整体来看，随着周龄数的增加，密度逐渐减小，但减小的趋势越来越不明显(图 2A1、2A2、2A3)。
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图 2 不同周龄新西兰白兔肌纤维密度和面积 Figure 2 Muscle fiber density and area of New Zealand white rabbits at different ages A1、A2和A3分别表示红肌纤维、中间型肌纤维和白肌纤维密度；B1、B2和B3分别表示红肌纤维、中间型肌纤维和白肌纤维面积。 |
在2~8周龄，肌纤维的面积随着周龄数的增加而逐渐变大，8周龄以后，面积变化的趋势不明显(图 2B1、2B2、2B3)。
2.3 新西兰白兔肌纤维的长径和短径随着周龄数的增大，新西兰白兔的背腿部各类肌纤维的长径和短径在2至8周龄(白肌纤维短径在2至6周龄)期间不断变大，在后期变化的趋势不明显(图 3)。
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图 3 不同周龄新西兰白兔肌纤维长径和短径 Figure 3 Long and short diameters for muscle fibers of New Zealand white rabbits at different ages A1、A2和A3分别表示红肌纤维、中间型肌纤维和白肌纤维长径；B1、B2和B3分别表示红肌纤维、中间型肌纤维和白肌纤维短径。 |
利用实时荧光定量PCR技术，检测了Myh6基因在新西兰白兔不同生长发育阶段背腿肌中的表达水平。结果(图 4)发现，随着周龄的增大，Myh6基因在新西兰白兔背腿肌中的表达量都呈现出先增大再变小最后趋于稳定的趋势，4周龄表达量最高。Myh6基因在母兔背肌中的表达量在6周龄以后基本趋于稳定，在母兔腿肌及公兔背腿肌中的表达量在8周龄以后趋于稳定。
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图 4 Myh6基因在不同周龄新西兰白兔背腿肌中表达水平 Figure 4 Expression levels of Myh6 genes in back and leg muscles of New Zealand white rabbits at different ages |
Myh6基因在背肌中的表达量与各类肌纤维性状的相关分析结果如表 2所示。该基因在公兔背肌中的表达量与红肌纤维的面积呈极显著负相关(P＜0.01)；与红肌纤维和中间型肌纤维的密度均呈显著正相关(P＜0.05)；与白肌纤维的密度、中间型肌纤维和白肌纤维的面积、3种肌纤维的长径、红肌纤维和中间型肌纤维的短径均呈显著负相关(P＜0.05)；该基因在母兔背部中的表达量与红肌纤维的密度呈显著正相关(P＜0.05)；与3种肌纤维的面积、长径、红肌纤维和中间型肌纤维的短径均呈显著负相关(P＜0.05)。该基因在公兔腿肌中的表达量与红肌纤维密度呈极显著正相关(P＜0.01)(表 3)。
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表 2 Myh6基因表达量与背部肌纤维性状的相关分析1) Table 2 Correlation analysis between Myh6 gene expression and back muscle fiber traits |
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表 3 Myh6基因表达量与腿部肌纤维性状的相关分析1) Table 3 Correlation analysis between Myh6 gene expression and leg muscle fiber traits |
各类肌纤维经琥珀酸脱氢酶染色法染色后均表现出不同的颜色。解祥学等[6]研究得出，不同类型肌纤维的琥珀酸脱氢酶活性不同，导致染色的结果不同，红肌纤维琥珀酸脱氢酶活性最强，染成蓝紫色，白肌纤维琥珀酸脱氢酶活性很低，不着色或者着色非常淡，而中间型纤维着色处于两者之间。不同品种肉牛，同一部位的肌纤维类型比例、肌纤维直径和肌纤维密度是存在差异的；6个品种牛不同部位均是白肌纤维直径＞中间纤维直径＞红肌纤维直径，肉牛与新西兰白兔3种肌纤维直径大小之间的差异趋势基本一致。陈岩锋等[7]在闽西南黑兔70、90、120日龄时测得背最长肌肌纤维直径分别为38.48、34.67、42.28 μm，背最长肌肌纤维面积分别为1 095.49、879.15、1 322.39 μm2，背最长肌肌纤维密度分别为419.09、418.88、332.10根·mm-2，并指出背最长肌的密度随着日龄数的增加而逐渐变小。本试验测得10周龄新西兰白兔背部和腿部红肌纤维、中间型肌纤维和白肌纤维的面积长径的结果与以上结果基本一致。赵海全等[8]对56日龄的天农草鸭的胸肌、腿肌肌纤维直径进行测定，测得公鸭胸肌、腿肌肌纤维直径分别为37.84、50.76 μm，母鸭胸肌、腿肌肌纤维直径分别为32.78、43.62 μm。本试验测得的8周龄新西兰白兔背部和腿部红肌纤维、中间型肌纤维和白肌纤维的长径结果与以上结果差异不明显，说明该试验结果的可靠性。另外，骨骼肌纤维的长短和粗细随肌肉的种类和生理状况而异，一般长1~40 μm，直径10~100 μm[9-12]。在本试验中测得的各周龄新西兰白兔背部和腿部红肌纤维、中间型肌纤维和白肌纤维的长径和短径结果基本在这一范围内。
研究表明，Myh6基因在心肌发育过程中发挥了重要作用。Myh6基因表达的下调可能会引起心房间隔缺陷[13]，Myh6等位基因的突变能抑制肥大型心肌病[14]，该基因表达变化对左心室的结构和功能改变有一定的影响[15]，Mef2缺失的果蝇Myh6基因表达下调，可出现肌球蛋白重链缺失[16]，表明Myh6基因对肌肉发育至关重要。在前期研究中，我们筛选的差异基因Myh6与家兔肌肉发育密切相关。本研究利用实时荧光定量PCR法对新西兰白兔不同周龄背部和腿部肌肉中Myh6基因的表达规律进行了相对定量分析，发现Myh6基因在该家兔品种中表达是随着周龄数的增加表达量先变大后变小最后趋于稳定，但是尚未发现这种表达量变化发生的机制。通过其表达量结果与切片结果的联合分析可以看出，该基因与肌纤维发育相关。该基因在4周龄表达量最高，与新西兰白兔在4周龄左右处于发育高峰期、肌肉的生长速度较快相一致。家兔在8周龄以后肌肉发育相对平缓，该基因在8周龄以后表达量趋于稳定。该基因在新西兰白兔母兔背肌中的表达量在6周龄后基本趋于稳定，在公兔背肌中的表达量在8周龄之后趋于稳定，公兔在6~8周龄时肌肉发育的速度大于母兔。根据Myh6基因表达量与新西兰白兔背腿部肌纤维性状的关联分析结果，说明家兔肌纤维的生长发育可能受Myh6基因表达的调控。
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