盐酸氯苯胍(Robenidine hydrochloride)是一种人工合成抗球虫药^[1]，分子式为C₁₅H₁₃Cl₂N₅·HCl，相对分子质量为370.66，在结构上属于胍基衍生物^[2]。该药于20世纪70年代初在美国上市并作为饲料添加剂被广泛使用，主要用于预防和治疗鸡的急球虫感染，对柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、变位艾美耳球虫等均有效果^[3]，具有毒性低、疗效高^[4]、抗虫谱广、成本低等优点。同时，该药物被证明具有轻微的促进营养吸收作用^[5]。我国批准用于禽、危球虫病的预防和治疗^[1]。目前该药物的研究集中于药物残留检测方法^[6-7]和提取方法^[8-9]，靶动物的药动学及生物利用度鲜见报道。本文对健康兔内服与静脉注射盐酸氯苯胍的药动学进行研究，以期丰富相关研究数据，并为盐酸氯苯胍残留的相关标准制定提供依据。

16只健康新西兰大白兔，公母各半，购自南方医科大学实验动物中心，体质量为(2.00±0.20) kg。试验前于代谢笼中饲养观察7 d，自由饮水采食。将16只兔随机分为2组，每组8只，第1组于左耳静脉注射给药，剂量为2 mg·kg^-1；第2组单次内服给药，剂量为100 mg·kg^-1(兽药使用指南内服推荐剂量为10~15 mg·kg^-1)。给药前12 h及给药后3 h禁食，仅可饮水。

盐酸氯苯胍标准品(w为99.8%，批号H0041110，对照)，购自中国兽医药品监察所；盐酸氯苯胍原料药(经测定w为90.30%)，由广州绿州生物技术有限公司提供；乙酸、乙酸乙酯、三氯甲烷、三乙胺和磷酸二氢铵，均为分析纯(天津市大茂化学试剂厂)；甲醇、乙腈和甲酸，均为色谱纯(Sigma公司)。

高效液相色谱仪：含二联泵、脱气泵、色谱工作站、紫外检测器、自动进样器，LC-20A型，日本岛津公司；电子分析天平：岛津AUW120D型，精度0.001 mg，日本岛津公司，超纯水系统：Milli-Q型，美国Millipore公司；高速冷冻离心机：Avanti^® J-26 XP型，美国Beckman-Coulter公司；台式冷冻离心机：LEGEND Mach1.6R型，ThermoFisher德国Sorvall公司；pH计：pHs-25型，上海精科雷磁仪器厂；旋涡振荡器：HS250 Basic型，马来西亚IKA公司。

1) 储备液：精密称取11.11 mg的盐酸氯苯胍标准品于10 mL棕色容量瓶中，用色谱甲醇溶解，制成含氯苯胍1 000 μg·mL^-1的标准储备液。放入4 ℃冰箱保存。2) 注射液：定量称取盐酸氯苯胍原料药，用体积分数为40%的N, N-二甲基乙酰胺水溶液稀释成4 mg·mL^-1的注射液，现配现用。3)0.05 mol·L^-1的磷酸二氢铵缓冲液：称取磷酸二氢铵5.75 g，于1 000 mL的容量瓶定容，用三乙胺调节pH至6.8。

静脉注射组于左耳耳缘静脉注射给药，在给药前(0 h)采集空白样品并在给药后的0.167、0.250、0.5、1.0、1.5、2、3、4、6、8、12、16、24 h分别从右耳采集血液样品。内服组混饲给药，在给药前(0 h)采集空白样品并在给药后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、16、24、36、48、72、96 h分别从双耳采集血液样品。采集血液置于肝素钠抗凝管中，混匀，3 000 r·min^-1，离心10 min，分离血浆，-20 ℃保存。

吸取血浆样品0.5 mL，置于5 mL的离心管中，加入体积分数为1%的乙酸乙酯3 mL，涡旋1 min，10 000 r·min^-1离心10 min(4 ℃)。吸取上清液置于15 mL玻璃管中，于40 ℃水浴氮气吹干，后用1 mL色谱甲醇复溶，0.22 μm滤膜过滤，装入进样瓶供HPLC进样分析。

色谱柱为Gemini 5u C18 100A(250 mm×4.0 mm×5 μm)，美国Penomenex公司。紫外检测波长为312 nm；流动相为磷酸二氢铵溶液-乙腈(体积比30：70) 溶液；柱温30 ℃，流速1 mL·min^-1，进样量为20 μL。

使用IBM公司的SPSS16.0统计分析软件计算血浆中盐酸氯苯胍浓度的平均值和标准差，同时以血药浓度平均值和时间作药-时曲线图。使用美国Pharsight公司的Winnonlin^TM非房室模型计算试验动物的药动学参数，

兔耳缘静脉注射盐酸氯苯胍(2.00 mg·kg^-1)后，不同时间的血药浓度见表 1，绘制的药-时曲线见图 1。采用非房室模型对血药浓度进行分析，得到的药动学参数见表 2。结果表明，静注给药后的药时曲线下面积AUC_0-t为1.72 μg·h·mL^-1，血浆清除率为1.17 L·h^-1·kg^-1，表观分布容积(V_d)为2.87 L·kg^-1，t_1/2为1.72 h。该药静脉注射后表观分布容积较大，表示药物大部分分布于组织，且消除迅速，在给药剂量为2.00 mg·kg^-1的情况下，血浆内的药物6 h即可基本消除。

表 1 Table 1

表 1 兔静脉注射盐酸氯苯胍(2.00 mg·kg-1)与内服盐酸氯苯胍(100.00 mg·kg-1)的血药浓度1) Table 1 The plasma drug concentrations in rabbits treated by intravenous and oral administration of robenidine hydrochloride at 2.00 and 100.00 mg·kg-1 respectively 静脉注射 内服 t采血/h ρ(盐酸氯苯胍) /(μg·mL-1) t采血/h ρ(盐酸氯苯胍) /(μg·mL-1) 0.167 1.57±0.12 1 ND 0.25 0.99±0.11 2 ＜LOQ 0.5 0.66±0.05 3 0.05±0.01 1 0.27±0.05 4 0.07±0.01 1.5 0.23±0.07 5 0.08±0.02 2 0.14±0.06 6 0.11±0.02 3 0.11±0.06 7 0.14±0.02 4 0.07±0.03 8 0.16±0.03 6 0.05±0.02 9 0.23±0.03 8 ＜LOQ 10 0.08±0.02 12 ＜LOQ 11 0.11±0.01 16 ＜LOQ 12 0.16±0.02 24 ND 16 0.18±0.03 24 0.17±0.02 36 0.08±0.01 48 0.06±0.01 72 ＜LOQ 96 ND 1)“＜LOQ”表示浓度低于定量限，“ND”表示未检测到，n=8。

表 1 兔静脉注射盐酸氯苯胍(2.00 mg·kg-1)与内服盐酸氯苯胍(100.00 mg·kg-1)的血药浓度1) Table 1 The plasma drug concentrations in rabbits treated by intravenous and oral administration of robenidine hydrochloride at 2.00 and 100.00 mg·kg-1 respectively

图 1 兔内服(100.00 mg·kg-1)与静脉注射(2.00 mg·kg-1)盐酸氯苯胍的药-时曲线图 Figure 1 Concentration-time curve of robenidine hydrochloride in rabbits treated by oral administration and intravenous administration at 100.00 and 2.00 mg·kg-1 respectively

表 2 Table 2

表 2 兔静脉注射和内服盐酸氯苯胍的药动学参数1) Table 2 The plasma pharmacokinetic parameters in rabbits treated by intravenous and oral administration of robenidine hydrochloride 药动学参数 静脉注射组 内服给药组 Kel/h-1 0.42±0.10 0.09±0.03* t1/2/h 1.72±0.39 8.94±3.45* tmax/h 20.00±8.81 Cmax/(μg·mL-1) 0.32±0.09 AUC0-t/(μg·h·mL-1) 1.72±0.44 6.33±2.38* Vd/(L·kg-1) 2.87±0.67 CL/(L· h-1·kg-1) 1.17±0.25 MRT/h 1.08±0.48 23.28±6.07* F/% 7.36 1)*表示内服给药组与静脉注射组比较差异极显著(P＜0.01，n=8，t检验)。

表 2 兔静脉注射和内服盐酸氯苯胍的药动学参数1) Table 2 The plasma pharmacokinetic parameters in rabbits treated by intravenous and oral administration of robenidine hydrochloride

兔内服盐酸氯苯胍(100.00 mg·kg^-1)后，不同时间的血药浓度见表 1，绘制的药-时曲线见图 1。采用非房室模型对血药浓度进行分析，得到的药动学参数见表 2。结果表明，盐酸氯苯胍内服给药吸收非常缓慢，达到高峰时间(t_max)为20 h，并且吸收较差，表现为C_max较低，仅为0.32 μg·mL^-1, AUC_0-t为6.33 μg·h·mL^-1，表明药物进入体内的总量很低；t_1/2为8.94 h，说明药物排泄缓慢，在体内保留时间较长；经计算，该药物的绝对生物利用度仅为7.36%，说明内服盐酸氯苯胍后，药物基本不吸收，而是主要以原型排出体外，这与田苗苗等^[10]的试验结果相符。此外，盐酸氯苯胍2种给药方式的各药动学参数均存在极显著的差异(P＜0.01)。

对于具有肝肠循环的药物来说，其静脉注射的药-时曲线往往具有再吸收的特点^[11-12]。从静脉注射盐酸氯苯胍的药动学参数可以看出，静脉注射给药时表观分布容积大，药物分布广泛，消除速度较快，血药中的药物浓度在6 h后便低于定量限，且在0~24 h的药-时曲线没有显示该药物具有再吸收的特点。一方面是由于药物的表观分布容积大，且在血浆中消除速度较快；另一方面可能与盐酸氯苯胍的在兔体内主要由肾脏代谢有关。该药物是否具有肝肠循环，还需进一步的试验验证。

观察内服盐酸氯苯胍的药-时曲线可知，该药物内服给药的药时曲线明显具有2个吸收过程，第1个吸收时段为0~8 h，为内服给药的常规吸收过程；第2个吸收时段为给药后12~24 h，且在此过程中到达最高浓度。本试验中，大白兔使用代谢笼进行饲喂，尿液与粪便及时分离回收，排除了动物因食粪造成药物再吸收的可能。药物在肠道内环境以及肠道微生物的作用下，代谢成水溶性强更易被肠道吸收的化合物。

在生产实践中，盐酸氯苯胍主要用于防治鸡、兔的球虫感染，作用部位在肠道，不需要吸收后发挥全身治疗作用，造成动物性食品中的药物残留。本研究中，内服给药的末端消除半衰期较长，生物利用度低表明内服给药消除缓慢，体内存留时间较长，进入动物体内的氯苯胍量较低。Zulalian等^[13]采用¹⁴C标记法对氯苯胍在鸡体内的代谢和残留规律研究发现，单剂量内服用¹⁴C标记的盐酸氯苯胍，鸡在24 h内排出标记放射性化合物为82%, 144 h后盐酸氯苯胍排出量达99%。田苗苗等^[10]的研究表明，兔内服氯苯胍后主要以原药的形式排出体外，随粪便排出的氯苯胍占内服总量的87.17%，尿液中氯苯胍占内服总量的0.56%。这与本试验的结果相符，也符合盐酸氯苯胍的临床用药目的。