磷是继氮之后作物所需的第2大营养元素，在作物光合作用、能量转移、信号转导及大分子物质的生物合成中都起着关键的作用^[1]。但根据资料调查显示，我国有74%的耕地土壤缺磷^[2]。可溶性磷肥施入农田后，由于土壤的固定作用，大部分迅速转变为作物难以吸收的无效磷，无法被植物直接吸收利用，导致作物对磷肥的当季利用率不超过30%^[3]。土壤中溶磷微生物能依靠自身的代谢或与其它生物协同作用^[4]，将不溶性磷转变成植物可吸收利用的磷。

溶磷菌可明显促进作物的株高、干质量^[5]及产量的增加^[6]，也可以促进作物对磷素的吸收^[7]，增加土壤生物量。因此，越来越多的溶磷菌被分离，主要集中在假单胞菌属Pseudomonas、埃希氏菌属Escherichia、肠细菌属Enterbacter等^[8]。不同的溶磷菌溶磷的形式不同。微生物分泌的有机酸可作为Ca²⁺的螯合剂，从而使磷从不溶性磷酸盐中释放出来。其中葡萄糖酮酸在土壤磷酸盐的风化和溶解过程中起着重要作用^[9]。Arvind等^[10]提出，参与直接氧化途径的葡萄糖脱氢酶(GDH)和葡萄糖酸脱氢酶(GADH)都定位在溶磷微生物的细胞膜外侧^[8]，当葡萄糖扩散至质膜时，在GDH的作用下被氧化成葡糖酸，葡糖酸进一步在GADH的作用下被直接氧化形成酸性特别强的葡糖酮酸^[11], 然后被分泌到细胞壁和细胞膜之间，使胞外处于酸性极高的环境，从而溶解不溶性磷酸钙^[12]。

FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)-GADH由FAD-脱氢酶大亚基、含有血红素C的中间亚单位和1个小亚基组成，大亚基和中间亚单位的功能主要是参与氢及电子的传递，小亚基功能未知^[13]。本研究以水稻根际土壤分离到的溶磷细菌—Serratia sp. NDW3为研究对象，对菌株NDW3 GADH小亚基基因ga2dh进行克隆与分析，旨在明确该基因的性质以及在菌株NDW3溶磷过程中的作用特点，进一步揭示溶磷菌的溶磷机制，为溶磷菌在农业生产上的应用提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 材料

菌株Serratia sp. NDW3为吉林农业大学作物营养代谢与调控实验室于2014年分离于吉林农业大学水稻试验田、具有较好溶磷能力的溶磷菌。大肠埃希菌菌株DH5α、BL21(DE3) 及载体pET28a(+)均为该实验室保存。pMD18-T载体试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒及限制性内切酶、Ex-Taq酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker、蛋白质分子量标准均购于TaKaRa公司。细菌RNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品，Easy Script TMFirst-strand cDNA Synthesis Super Mix反转录试剂盒为北京全式金生物技术有限公司产品，其它试剂均为国产分析纯。

NBRIP (National botanical research institute′s phosphate)培养基及LB培养基的配制参照文献[14]。

1.2 菌株NDW3溶磷量的测定

采用钼蓝比色法测定菌株的溶磷量^[15]，以NBRIP为基础培养基，Ca₃(PO₄)₂为唯一磷源，接种等量灭活菌液为对照。菌株NDW3接种在LB培养基中，当培养液细胞浓度为D_{600 nm} =0.6时，菌液以$\varphi $为1%的接种量接入装有50 mL液体培养基的150 mL三角瓶中，30 ℃，150 r·min^-1进行培养，重复3次。每隔12 h取样1次，将2 mL发酵液，10 000 r·min^-1离心5 min，取1 mL上清液加水至3 mL，加入3 mL定磷试剂，测定上清液的含磷量，计算供试菌株的溶磷量；菌体用于RNA的提取。

1.3 GADH活性的测定

GADH活性测定参照Yang等^[16]方法：通过铁氰化钾作为电子受体，取780 μL McIIvaine缓冲液放入25 mL离心管中，然后加入0.1 mol·L^-1铁氰化钾和1 mol·L^-1葡萄糖酸钠各100 μL，混匀后加入20~200 μL提取的粗酶液，再加入500 μL铁-Dupanol溶液终止反应，25 ℃温育20 min进行显色，最后加入3.5 mL去离子水，在波长为660 nm条件下测定光密度值，空白对照用去离子水代替酶液。GADH酶活力单位被定义为每分钟内催化1 μmol葡萄糖酸钠所需的酶量(4.0个光密度等于氧化1 μmol的葡萄糖酸)，酶活性用每毫克蛋白的酶活力单位数表示。

1.4 荧光定量PCR

根据细菌总RNA试剂盒方法提取菌株NDW3的RNA，采用Easy Script ^TM First-strand cDNA Synthesis Super Mix反转录试剂盒合成cDNA。实时荧光定量PCR采用定量试剂SYBR Premix ExTaq^TM进行扩增反应，用Primer 5.0软件设计目的基因引物，GA2DH-F：5′-CATCGTTTACAGCGTGGACTAC-3′，GA2DH-R:5′-TCCAGGTGTAGCGGTGAAATG-3′，内参基因为16S rRNA，引物16S-F: 5′-CCAACCGACCTTTTTCACCC-3′, 16S-R: 5′-TACGGCGTGTTCAT-CTGGC-3′。反应体系为20 μL，包括SYBR Premix ExTaq^TM Ⅱ (2×) 10 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH₂O 6.0 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃复性30 s，40个循环。每个反应设置3次重复。利用Step One生物软件和Microsoft Excel分析处理试验结果，参照ABI公司提供的ΔΔ Ct计算方法计算基因相对表达量。

1.5 ga2dh基因的克隆与序列分析

从GenBank上检索序列，根据同属菌ga2dh基因的序列设计引物。以菌株NDW3的基因组DNA为模板，分别以ga2dh-F: 5′-GACTATCTTTGGATGGAATGTG-3′和ga2dh-R: 5′-GCGTCTACTTTTTTCA-TTACCG-3′为引物进行PCR扩增。PCR产物经10 g·L^-1琼脂糖凝胶电泳检测，检测正确的DNA片段经凝胶试剂盒回收与pMD18-T载体连接，转化大肠埃希菌DH5α。经酶切及PCR验证为阳性的克隆送上海生工生物工程公司测序。将核苷酸序列转化成氨基酸序列后进行BLAST分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，并利用SWISS-MODLE网站进行结构预测，TMHMM-2.0软件进行蛋白质跨膜区域的预测。

1.6 原核表达载体pET-28a-ga2dh的构建与鉴定

以测序为阳性的重组质粒pMD18-T-ga2dh为模板，两端具有EcoR I/XhoI酶切位点的引物Ga2dh-F:5′-CCGGAATTCGACTATCTTTGGATGGAATGTG-3′和Ga2dh-R:5′-CCGCTCGAGGCGTCTACTTTTTTCATTACCG-3′(下滑线部分为酶切位点)进行PCR，获得两端分别带有EcoR I和Xho I酶切位点的目的片段。EcoR I和Xho I双酶切目的片段和pET28a(+)，凝胶回收并于16 ℃金属浴内连接12 h。连接产物42 ℃热激转化大肠埃希菌BL21(DE3) 感受态细胞。

1.7 重组质粒pET-28a-ga2dh在大肠埃希菌体内的诱导表达

将鉴定为阳性的BL21(pET-28a-ga2dh)挑取单菌落到含卡那霉素(Kan)的LB液体培养基中，37 ℃，160 r·min^-1，过夜培养。以$\varphi $为1%的接种量将过夜培养的菌液转接到含有Kan抗性的LB液体培养基中, 37 ℃，160 r·min^-1培养至D_{600 nm}=0.6。加入IPTG使其终浓度为1.0 mmol·L^-1，诱导2和4 h，各取1 mL菌液，10 000 r·min^-1，离心10 min收集菌体。将收集到的菌体加入100 μL样品溶解液充分混匀。100 ℃处理10 min，裂解菌体细胞。12 000 r·min^-1离心10 min，收集上清，上样20 μL，采用12%的分离胶和5%的浓缩胶进行SDS-PAGE电泳检测蛋白表达。

1.8 大肠埃希菌GADH活性的测定

菌体BL21(pET-28a-ga2dh)及BL21(pET-28a)GADH活性测定方法如下：将过夜培养的菌悬液，按$\varphi $为0.5%接种于100 mL LB培养基，当培养液细胞浓度D_{600 nm} =0.6时，继续培养4 h。每隔1 h取菌液20 mL, 4 ℃，10 000 r·min^-1离心10 min后，收集菌体。向菌体中加入含有1 mmol·L^-1 β-巯基乙醇的0.01 mol·L^-1 pH=6的磷酸盐缓冲液10 mL，超声破碎20 min(功率50%，10 s工作，20 s间歇)，4 ℃浸提3 h。4 ℃，12 000 r·min^-1离心10 min，去上清，向其中加入含有$\varphi $为1%的Triton-X 100的0.01 mol·L^-1 pH=6的磷酸盐缓冲液3 mL，0 ℃，80 r·min^-1 3 h，之后4 ℃浸提过夜，12 000 r·min^-1离心10 min后，上清即为粗酶液。酶活性的测定参照“1.3”, 数据采用Duncan’s新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析 2.1 NDW3溶磷量、GADH活性、ga2dh基因表达

为了明确GADH小亚基基因ga2dh的表达与GADH活性及溶磷之间的关系，测定了菌株NDW3在96 h内溶磷量的变化及GADH的活性。如图 1所示，随培养时间的延长，溶磷量在36 h之前表现出不断增加的趋势，36~96 h内变化不明显。GADH活性在12 h时较小，24 h时达到峰值，然后逐渐降低。48 h内ga2dh表达量随着时间的增加而下降，12 h相对表达量远高于48 h。

2.2 ga2dh基因的克隆与鉴定

如图 2所示，以Serratia sp. NDW3提取的基因组DNA为模板，PCR扩增出约780 bp左右清晰的目的片段。利用PCR和双酶切验证目的片段与pMD18-T载体的连接，PCR与酶切都获得清晰的目的条带，说明目的基因与载体连接成功。

2.3 ga2dh基因序列分析

利用BLAST对ga2dh基因序列及GenBank核酸数据库进行分析。菌株NDW3的ga2dh基因序列与Serratia sp. SCBI (CP003424.1) 相似性最高，为99.62%。ga2dh基因的生物信息学分析结果见图 3。从图 3A看出，ga2dh基因编码的蛋白属于葡萄糖酸脱氢酶亚基3超家族，结构主要由3个α-螺旋构成，且预测结果的局部相似性均超过0.6。利用TMHMM-2.0将蛋白质序列进行跨膜区的预测(图 3B)，结果发现蛋白质序列中前12个氨基酸位于胞内，36位氨基酸之后形成的蛋白质结构位于胞外，13~35氨基酸位点之间形成跨膜的区域。

2.4 ga2dh基因在大肠埃希菌中的表达 2.4.1 原核表达载体pET-28a-ga2dh的构建

利用测序结果正确的pMD18-T-ga2dh为模板进行PCR，获得两端带有EcoR I和Xho I酶切位点的目的片段，利用双酶切与载体pET-28a进行连接，并转化大肠埃希菌BL21。阳性克隆提取质粒，并进行双酶切验证。结果如图 4所示，酶切后的基因片段及载体大小分别与目的基因及pET-28a载体的大小一致，说明原核表达载体pET-28a-ga2dh构建成功。

2.4.2 原核表达载体在大肠埃希菌中的诱导表达

将BL21(pET-28a-ga2dh)进行诱导表达，SDS-PAGE电泳结果如图 5所示，BL21(pET-28a-ga2dh)在相对分子质量约27 000处存在明显的蛋白表达条带，且含量远高于对照，说明该基因在大肠埃希菌BL21中可以表达。

2.4.3 大肠埃希菌BL21菌体GADH活性分析

利用LB培养基对带有不同质粒的BL21菌株进行培养，GADH活性如表 1所示。结果表明：BL21(pET-28a-ga2dh)菌株GADH活性随着培养时间增加而逐渐增强，在4 h时菌株的酶活性为411.67 U·mg^-1，显著高于其他时间段(P < 0.05)。BL21(pET-28a)菌株在4 h内GADH活性也随着时间的增加而增强，但同一时间内，酶活性都远低于BL21(pET-28a-ga2dh)，且4 h时，酶活性仅为BL21(pET-28a-ga2dh)体内酶活性的20.65%。这说明GADH小亚基基因ga2dh的表达，能够使大肠埃希菌BL21 GADH的活性显著增加。

3 讨论与结论

Serratia sp.是1类具有溶磷能力的革兰阴性菌株，Serratia marcescens GPS 5^[17]，Serratia sp. MSK1^[18]等菌株已被分离并鉴定。本研究从水稻根际土壤中也分离到1株溶磷能力较好的菌株Serratia sp. NDW3。Goldstein等^[19]认为菌株溶磷的特性受无机磷酸盐浓度的影响。本试验以NBRIP为培养基，不溶性磷酸钙为唯一磷源时，随培养时间的延长，菌株NDW3溶磷量表现出先增加，36 h后趋于稳定的趋势, 这说明菌株NDW3溶磷可能同样受不溶性磷的调节，培养基中可溶性磷浓度达到一定值时，菌株溶磷特性受到抑制。

溶磷微生物的溶磷机理非常复杂，Sashidhar等^[8]认为葡萄糖直接氧化成葡萄糖酸是细菌溶磷的主要机制，革兰阴性细菌由于能分泌大量的有机酸进入外膜空间，其溶磷效果要好于革兰阳性菌。研究发现参与直接氧化途径的酶GDH和GADH都锚定在内膜上，但催化结构域却朝向细胞质膜的外表面，直接氧化途径产生的葡萄糖酸和2-酮基葡糖酸被分泌到细胞壁和细胞膜之间，使胞外处于酸性极高的环境^[8]。ga2dh基因编码GADH分子的1个小亚基，本试验发现ga2dh基因的相对表达量在12 h最大，GADH活性在24 h达到最大值，而溶磷量在36 h后趋于稳定，这种规律可能是因为菌体内ga2dh基因表达后，GADH蛋白的形成需要一定的时间，或在培养过程中随着时间的增加，pH会抑制葡萄糖酮酸的产生，从而对酶产生了反馈抑制作用。ga2dh基因表达量、酶活性与溶磷量三者表现出依次滞后的趋势与高度相关性，说明Serratia sp. NDW3菌株溶磷的主要机制可能仍是依赖于直接氧化途径。生物信息学分析发现ga2dh基因编码的蛋白质序列存在跨膜以及胞内和胞外的区域。在大肠埃希菌中表达该基因可以明显增加菌体GADH的活性。这说明ga2dh基因编码的小亚基不仅对GADH活性起重要作用，也是介导GADH的跨膜结构的重要组成部分。