2017, Vol. 38
牛流行热是由牛流行热病毒(Bovine ephemeral fever virus, BEFV)引起的一种非接触传染性疾病，黄牛、奶牛和水牛易感，其他反刍动物也可感染本病[1]。该病主要由蚊虫叮咬而传播，临床上以突然发热、精神沉郁、大量流涎、僵硬、跛行，甚至卧地不起等为特征。本病传播迅速，发病率高，病死率近年来有所上升，甚至出现急性呼吸衰竭病例。本病通常呈周期性流行，每隔3~5年发生1次较大规模的流行，发病季节多为5—10月份。世界多地均有此病流行[2]。我国最早在1955年就出现过本病的报道，1976年首次分离到牛流行热病毒株JB76H[3-4]。广东地区近几年均有发生，该病的发生周期有变短的趋势，严重危害养牛业[4]。
牛流行热的常规诊断方法为血清学检测方法[5-7]，目前，国内主要采用微量血清中和试验方法，由于需使用活病毒，且在试验前需要测定病毒的TCID50，不仅费时费力，检测周期长，影响了牛流行热的快速诊断，还存在病毒污染扩散的风险。ELISA检测技术的建立，某种程度也为牛流行热抗体的筛查提供了便利条件[8]，核酸检测技术中的普通PCR和荧光定量PCR等技术，具有敏感、快速、特异和高通量等优点[9-10]，已广泛用于多种重要疫病病原体的检测，刘志玲等[11]建立了牛流行热病毒LUX-TM荧光RT-PCR检测方法，具有较好的检测准确度和灵敏度，但是荧光定量检测需要昂贵的仪器，且检测试剂成本较高。建立快速高效、低成本的分子生物学诊断方法，对牛流行热的防控具有重要的意义。
逆转录环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isthermal amplification，LAMP)技术的出现，在多种病原的检测方面发挥了巨大的作用，尤其是该方法简便、易于操作，对仪器设备要求不高，适合临床生产一线使用[12-14]。通过对LAMP技术的改进，在反应体系中加入显色成分钙黄绿素，还能实现反应产物的可视化[15]。这样直接通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，具有较好的临床应用前景。
1 材料与方法 1.1 病毒RNA2013—2015年广东地区牛流行热流行期病牛抗凝血由本实验室采集保存，赤羽病病毒(Akabane virus, AKV)核酸、牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)核酸、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)核酸由广东检验检疫技术中心动检实验室惠赠。
1.2 试剂RNA抽提试剂盒购自Invitrogen；AMV Reverse Transcriptase购自Promega公司；Bst DNA聚合酶购自TOYOBO公司；甜菜碱购自Sigma公司。
1.3 仪器Bio-Rad梯度PCR仪、Bio-Rad型电泳仪：美国Bio-Rad公司生产；凝胶成像系统：美国Alpha公司生产；5810R冷冻离心机：德国Eppendorf公司生产；恒温水浴箱：德国GFL公司生产。
1.4 引物的设计与合成参照Genbank中BEFV糖蛋白G的基因序列，应用DNAStar 7.0软件MegAlign 5.0程序进行分析，利用在线软件(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0 /index.html)在序列保守区域设计LAMP引物(表 1)，其中，F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引物。
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表 1 LAMP引物 Table 1 LAMP Primers |
按照RNA抽提试剂盒的说明书进行病毒RNA的抽提，提取的RNA在-80 ℃条件下保存备用。
1.6 RT-LAMP方法的优化及建立参照国内其它病毒的LAMP检测反应体系，以牛流行热病毒RNA为模板，先建立一个25 μL LAMP反应体系：5 mmol·L-1的甜菜碱5.0 μL、100 mmol·L-1的MgSO4 1.0 μL、8 U·μL-1的Bst DNA聚合酶1.0 μL、10×Bst DNA聚合酶缓冲液2.5 μL、10 mmol·L-1的dNTPs 3.0 μL、BIP(20 μmol·L-1)2.0 μL +FIP(20 μmol·L-1)2.0 μL、F3(20 μmol·L-1)2.0 μL +B3(20 μmol·L-1)2.0 μL、模板RNA 1 μL、5 U·μL-1的AMV反转录酶1.0 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、加DEPC水至25 μL。阴性对照模板为DEPC水，反应后用15 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
之后根据反应优化策略，对Mg2+浓度、甜菜碱浓度、Bst DNA聚合酶浓度、dNTP浓度、引物浓度等条件分别进行优化。设置反应温度为60、61、62、63、64和65 ℃，确定最佳退火温度。反应时间以10 min起始，每隔10 min取样检测至1 h，确定最佳反应时间。
1.7 RT-LAMP方法的灵敏性检测将抽提获得的RNA进行10倍梯度逐级稀释，以100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6不同稀释液作为模板，利用所建立的RT-LAMP反应体系和RT-PCR检测方法进行灵敏性比对。
1.8 RT-LAMP方法的特异性检测分别抽提牛流行热病毒(BEFV)、牛赤羽病病毒(AKV)、牛传染性支气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)RNA，同时设立阴性对照，采用上面已经优化的反应体系和条件，检测RT-LAMP方法的特异性。
1.9 RT-LAMP反应产物的分析LAMP反应体系存在扩增产物，在反应前RT-LAMP体系中按体积比加入1:10的钙黄绿素和氯化锰，反应结束后，样品根据反应结果不同而呈现不同颜色。使用琼脂糖凝胶电泳技术对产物进行分析，阳性反应呈现弥散型条带。
1.10 临床样品检测对采集自广东地区的56份疑似病牛全血，经RNA抽提后分别进行LAMP检测和普通PCR检测。
2 结果与分析 2.1 LAMP反应条件的优化通过对反应体系的优化，可见当Mg2+浓度为3 mmol·L-1(图 1)、甜菜碱浓度为0.4 mol·L-1(图 2)、dNTPs mix浓度为1.2 μmol·L-1(图 3)、反应温度为63 ℃(图 4)、内外引物浓度比例为8:1(图 5)时反应梯形条带最明显，在反应40 min后可以观察到明显的梯形条带(图 6)，随着时间的延长，条带变得更加清晰。
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图 1 LAMP反应体系Mg2+浓度的优化 Figure 1 Optimization of Mg2+ concentration in the LAMP reaction system M：DL2000 Marker；1：1 mmol·L-1；2：2 mmol·L-1；3：3 mmol·L-1；4：4 mmol·L-1；5：5 mmol·L-1；6：6 mmol·L-1；N：阴性对照。 |
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图 2 LAMP反应体系甜菜碱浓度的优化 Figure 2 Optimization of betaine concentration in the LAMP reaction system M：DL2000 Marker；1：0.4 mol·L-1；2：0.6 mol·L-1；3：0.8 mol·L-1；4：1.0 mol·L-1；5：1.2 mol·L-1；6：1.4 mol·L-1；N：阴性对照。 |
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图 3 LAMP反应体系dNTPs mix浓度的优化 Figure 3 Optimization of dNTPs mix concentration in the LAMP reaction system M：DL2000 Marker；1：0.8 μmol·L-1；2：1.2 μmol·L-1；3：1.6 μmol·L-1；4：2.0 μmol·L-1；5：2.4 μmol·L-1；6：2.8 μmol·L-1；7：3.2 μmol·L-1；N：阴性对照。 |
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图 4 LAMP反应温度的优化 Figure 4 Optimization of LAMP reaction temperature M：DL2000 Marker；1：60℃；2：61℃；3：62℃；4：63℃；5：64℃；6：65℃。 |
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图 5 LAMP反应体系内外引物比例优化 Figure 5 Optimization of the ratio of inner to outer primers in the LAMP reaction system M：DL2000 Marker；1：0.2 μmol·L-1(FIP+BIP), 0.2 μmol·L-1(F3+B3)；2：0.2 μmol·L-1(FIP+BIP), 0.4 μmol·L-1(F3+B3)；3：0.2 μmol·L-1(FIP+BIP), 0.8 μmol·L-1(F3+B3)；4：0.2 μmol·L-1(FIP+BIP), 1.0 μmol·L-1(F3+B3)；5：0.2 μmol·L-1(FIP+BIP), 1.2 μmol·L-1(F3+B3)；6：0.2 μmol·L-1(FIP+BIP), 1.6 μmol·L-1(F3+B3)；7：0.2 μmol·L-1(FIP+BIP), 1.8 μmol·L-1(F3+B3)；8：0.2 μmol·L-1(FIP+BIP), 2.0 μmol·L-1(F3+B3)；N：阴性对照。 |
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图 6 LAMP反应时间的优化 Figure 6 Optimization of LAMP reaction time M：DL2000 Marker；1：10 min；2：20 min；3：30 min；4：40 min；5：50 min；6：60 min。 |
由图 7可见，在将RNA原液稀释100、10-1、10-2和10-3倍后作为模板时，LAMP扩增的产物都出现明显的梯形条带，而普通PCR的扩增产物只有当RNA原液稀释100、10-1和10-2倍出现明显的条带，两者的检测灵敏度相比，LAMP的检测灵敏度提高了10倍。
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图 7 LAMP扩增与PCR灵敏性对比 Figure 7 Sensitivity comparison of LAMP and PCR M：DL2000 Marker；1~6：RNA稀释倍数依次为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-6。 |
分别以BEFV、AKV、IBRV、BVDV作为样品，检测建立的LAMP方法的特异性。从图 8中可以看出，只有以BEFV阳性样品为模板的泳道内出现了明显的梯形条带，其他样品为阴性。结果表明LAMP引物对BEFV具有专一性，依此可区分与牛流行热症状相似的一些牛病。
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图 8 BEFV LAMP反应特异性 Figure 8 Specificity of the LAMP assay detecting BEFV M：DL2000 Marker；1：BEFV(牛流行热病毒)；2：AKV(赤羽病病毒)；3：IBRV(牛传染性鼻气管炎病毒)；4：BVDV(牛病毒性腹泻病毒)；N：阴性对照。 |
LAMP反应体系存在扩增产物，在反应前RT-LAMP体系中按体积比加入1:10的钙黄绿素和氯化锰，反应结束后，阳性样品呈浅绿色，阴性样品呈橘红色(图 9)。
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图 9 BEFV LAMP可视化检测结果 Figure 9 Visualization test of the LAMP assay detecting BEFV 1：阴性样品；2~4：阳性样品。 |
对临床采集的56份疑似牛流行热样品进行检测。PCR方法检测出5份阳性样品，阳性检出率为8.93%，而LAMP方法则检测出6份阳性样品，阳性检出率为10.70%。
3 讨论与结论LAMP是一种在恒温条件下，高效、特异、快速的扩增靶标序列的核酸检测技术[11]。本研究在牛流行热病毒G蛋白基因的6个位点设计4条引物，通过对反应体系和反应条件的优化，建立了可视化RT-LAMP检测方法。利用该方法对牛流行热病毒(BEFV)及IBRV、AKAV、BVDV的RNA进行特异性检测，结果表明该可视化LAMP检测方法对BEFV具有良好的特异性，对BEFV病料中核酸的最低检测限是常规PCR灵敏度的10倍。采用该方法对临床样品进行检测，其中阳性检出率为10.70%，高于普通PCR的检出率(8.93%)。为了便于结果的观测，国内外学者对LAMP检测技术进行显色反应[15]。目前的研究中多数采用SYBR Green I，该方法需在反应结束后打开反应管，加入SYBR Green I方能发挥显色指示作用，根据颜色的不同，从而判定检测结果，该方法简便易行，试剂也相对便宜，但是显色反应需要开盖添加SYBR Green I，这时容易产生气溶胶，由于LAMP反应本身的高特异性和灵敏性，极易导致实验室污染，产生假阳性结果。也有研究者使用浊度仪实时监测LAMP反应结果，但该方法在实际操作中要使用价格昂贵的浊度仪，不利于基层实验室开展检测工作。本研究利用钙黄绿素与Mn2+结合而不发荧光，随着反应的进行，产生了大量更易与Mn2+结合的焦磷酸根离子，从而释放钙黄绿素，游离的钙黄绿素可自发荧光，且Mg2+存在的环境中荧光效果得到加强的原理，使用钙黄绿素+Mn2+混合液替代SYBR Green I进行结果显色指示[15]，无需开盖，直接通过肉眼观察颜色变化即可判定检测结果[15]。
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