2017, Vol. 38
2. 广东省环境保护职业技术学校，广东 广州 510655;
3. 广东省农业有害生物预警防控中心，广东 广州510500
2. Guangdong Vocational and Technotogical School of Environmental Protection, Guangzhou 510655, China;
3. Agricultural Pest Prevention and Control Center of Guangdong Province, Guangzhou 510500, China
印楝素(Azadirachtin)是一类从印楝Azadirachta indica中分离出来的活性较强的化合物，它属于四环三萜类，结构复杂，其活性最好的是印楝素A，目前发现的活性成分还有印楝素B等[1]。印楝素是世界公认的低毒、广谱、高效、易降解的杀虫剂[2-3]。到目前为止，我国尚未出台印楝素的最大允许残留值及相关检测方法，但根据欧盟地区的标准，蔬菜中印楝素的MRL为1.0 mg·kg-1。目前，分光光度法在测定印楝素总含量方面的应用较为普遍[4-5]，但其他物质容易对其产生干扰；对于较高含量的印楝素的测定，可用薄层色谱酸化香兰素显色法[6]；液相色谱法可用于分析植物生长与印楝素的相关性[7]和茶叶中印楝素的残留量[8]，也可分析水[9]、土壤[10]和橄榄树Canavium album[11]中印楝素的降解。
对印楝素在草莓Fragaria ananassa、番茄Solanum lycopersicum等水果上的残留已有研究报道[12-14]，而在蔬菜上的残留则鲜见报道。本研究根据文献[15]中的方法设计田间试验，印楝素乳油施用于甘蓝田后，采用超声波萃取、固相萃取净化、高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)测定甘蓝和土壤中印楝素的残留，记录印楝素在甘蓝及土壤中的消解动态，以期规避农药残留风险。
1 材料与方法 1.1 材料Agilent1100高效液相色谱仪(配DAD检测器、自动进样器、化学工作站)；旋转蒸发器EYELAN-1100(日本EYELA公司)；超声波清洗器KH-500(昆山创超声仪器有限公司)；循环水真空泵SHB-Ⅲ；组织捣碎机MJ-25BM02C(常州博远实验仪器厂)；烘箱S.C.101(上海试验仪器厂)；万分之一电子天平BS210S(德国Sa RtoRius公司)；精密移液枪(德国艾本德公司)。
SPE小柱(Florisil，标准样品为1g)；w为95%印楝素标准品(美国Sigma公司)；甲醇和乙腈为色谱纯(美国MREDA公司)；w为0.3%印楝素乳油(成都绿金生物科技有限责任公司)；乙腈、丙酮、氯化钠、正己烷为分析纯(天津富宇精细化工有限公司)，自制超纯水，电阻≥18.0 MΩ。
1.2 方法 1.2.1 田间试验方案及样品采集试验小区面积均为30 m2，另外设空白对照区，每组3个重复，并在各小区间进行相应隔断处理。采用常规手动喷雾器对甘蓝进行喷雾处理，1次施药，多次取样。施药时间结合甘蓝的害虫防治期和推荐采收间隔期确定。施药剂量是5.4 g·m-2。土壤残留消解动态试验在旁边随机选择的空白地进行。于药后1、6 h和1、2、3、4、5、7 d采集样品。每次在每个小区内随机采集多于1 kg生长正常的植株，在小区内随机采集深度为0~10 cm处的土壤，且多于1 kg。样品采集后放入样品袋，并尽快运回实验室在-20 ℃的冰箱中保存待测。
1.2.2 印楝素的提取准确称取20 g甘蓝样品放入匀浆机中并加入乙腈100 mL，高速匀浆2 min后用滤纸过滤，将滤液加入到含有氯化钠(6 g)的量筒中，剧烈震荡数分钟后静置30 min，使乙腈和水分层，吸取上清液50 mL，加入平底烧瓶中，在40 ℃的条件下减压浓缩处理，加V(正己烷):V(丙酮)=7:3的混合液2 mL溶解，待净化。准确称取20 g土壤加入到三角瓶中，并加入乙腈100 mL，超声提取30 min，过滤，将滤液加入到含有氯化钠(6 g)的量筒中，剧烈震荡数分钟后静置30 min，使乙腈和水分层，吸取上清液50 mL，加入平底烧瓶中，在40 ℃条件下进行减压浓缩处理，其后用甲醇定容到1 mL并经微孔滤膜过滤后，进行测定。
1.2.3 样品净化预先用V(正己烷):V(丙酮)=7:3的混合液5 mL活化Florisil固相萃取柱，转移提取液到柱上，用V(正己烷):V(丙酮)=7:3的混合液进行洗脱处理，每次5 mL，共洗脱3次，然后在40 ℃条件下用氮吹仪进行浓缩，其后用甲醇定容到1 mL并经微孔滤膜过滤后，进行测定。
1.2.4 液相色谱色谱柱为Agilent TC-C18(5 μm)，250 mm×4.6 mm；柱温30 ℃；流动相为V(乙腈):V(水)=40:60；流速1 mL·min-1；二极管阵列检测波长217 nm，进样量10 μL。定量方式采用外标法。在上述检测条件下印楝素的保留时间为9.80 min。
2 结果与分析 2.1 印楝素在甘蓝和土壤中的添加回收率及检出限以200 mg·kg-1印楝素标样测定的标准曲线如图 1A所示。在0.5~5.0 mg·kg-1线性范围内，进行添加回收处理，分别在空白甘蓝和空白土壤中，准确添加3个质量分数(0.1、0.5、1.0 mg·kg-1)的印楝素标准溶液，每个质量分数重复5次，然后测定回收率，添加回收色谱图见图 1B，由图 1B可知，印楝素峰形好、重现性较好且未见杂质干扰。印楝素在土壤中平均回收率为90.69%~93.32%，相对标准偏差为2.09%~3.46%，在甘蓝中的平均回收率为88.52 %~93.21%，相对标准偏差为2.75%~3.55%(表 1)。此方法的准确度和精密度均符合农药残留分析的要求。该方法的最小检出量为2 ng，印楝素的最低检出浓度为0.02 mg·kg-1。
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图 1 甘蓝添加印楝素的高效液相色谱图 Figure 1 HPLC chromatogram of cabbage sample spiked with azadirachtin |
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表 1 印楝素在甘蓝和土壤的添加回收率 Table 1 Recovery rates of azadirachtin in cabbage and soil |
空白对照组的液相色谱图见图 2。表 2为0.3%(w)印楝素乳油在甘蓝和土壤上的消解动态，当施药量为2.7 g·m-2时，印楝素在甘蓝和土壤中的原始沉积量分别为3.93和0.31 mg· kg-1，药后5 d在甘蓝和土壤中印楝素的残留量分别为0.07和0.06 mg·kg-1，消解率分别为98.21%和80.64%。印楝素在甘蓝和土壤中的消解动态符合一级反应动力学，即Ct=C0e-kt，运用DPS进行统计分析后，可以得到印楝素在甘蓝和土壤中的残留消解的动态方程(表 2)。由表 2可知，印楝素在甘蓝中的半衰期为0.89 d，在土壤中的半衰期为2.40 d。
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图 2 空白对照的高效液相色谱图 Figure 2 HPLC chromatogram of control without azadirachtin |
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表 2 0.3%(w)印楝素乳油在甘蓝和土壤中的消解动态 Table 2 Dissipation dynamics of 0.3% azadirachtin EC residue in cabbages and soil |
本研究建立了较为简便的检测印楝素在甘蓝和土壤中残留的方法。试验结果表明，经过此方法处理的样品，液相色谱图峰形良好且该方法的添加回收率及准确度等均符合要求。本研究用2倍的推荐剂量对田间甘蓝进行施药，6 h后印楝素的残留量就已经低于检出限而检测不出。为了进一步获得印楝素在甘蓝上残留降解行为的信息，本研究采用了20倍的推荐剂量施药，施药后1 h在甘蓝上的原始沉积量为3.93 mg·kg-1，半衰期为0.89 d，7 d后已检测不出。施药后1 h在土壤中的原始沉积量为0.31 mg·kg-1，半衰期为2.40 d。印楝素属于植物性杀虫剂，目前国内鲜见印楝素在蔬菜上的MRL和安全使用标准。欧盟则规定印楝素在蔬菜上的MRL为1.0 mg·kg-1，安全间隔期为3 d。根据本研究结果，并参照FAO/WHO和国内农药残留限量标准，可知印楝素属于低毒、低残留农药。但为了保证安全，仍需进一步开展各种试验，多积累数据并结合毒性资料等来制定印楝素在农产品中的MRL值。
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