2017, Vol. 38
2. 海大集团，广东 广州 511400
2. Haid Group, Guangzhou 511400, China
谷胱甘肽(Glutathione，GSH)主要是在肝脏以谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸为底物合成[1]，广泛分布于所有生物细胞中，其中，动物的肝脏、肾脏含量较为丰富[2]。GSH具有保护机体酶蛋白巯基不被氧化，促进自由基清除，减少自由基对细胞损伤，调节机体免疫机能等作用[3]。GSH作为药物已广泛应用于人类医疗[4]，作为功能性食品添加剂及营养强化剂用于食品生产[5]。
有研究表明，在草鱼饲料中添加GSH能够增强生长激素活性，促进草鱼生长[6]。在凡纳滨对虾饲料中添加GSH能够提高对虾成活率和饲料转化率[7]。在吉富罗非鱼饲料中添加GSH能够促进生长激素的分泌、蛋白质合成和细胞增殖[8]，提高生长性能和免疫相关酶活性[9]。在奥尼罗非鱼Oreochromis niloticus×O. aureus饲料中添加GSH能促进幼鱼生长，提高饲料利用率，促进IGF-I和T3分泌，提高机体抗氧化能力[10]。目前，鲜见在细胞水平上探讨谷胱甘肽的作用及其机理，通过细胞水平的研究，将从不同层面和水平揭示 GSH 作用机理。因此，本试验通过奥尼罗非鱼肝脏原代细胞培养，研究GSH 对细胞增殖的影响，初步揭示 GSH 的促生长作用机理，为 GSH 在水产动物饲料中应用提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验鱼和主要试剂奥尼罗非鱼购自广州白云区鱼苗厂，体质量约为30 g，鱼体消毒后在水族箱中暂养3周，备细胞培养用，暂养期间投喂不添加GSH的纯化饲料，饲料配方的质量分数为：干酪素35%、马铃薯淀粉45%、玉米油5%、微晶纤维素5%、羧甲基纤维素钠2%、矿物质预混物5%、维生素预混物3%。谷胱甘肽购自AMRESCO公司(φ≥99%)。DMEM/F12 培养液和II型胶原酶干粉购自GIBCO公司。
1.2 肝细胞原代培养罗非鱼用φ为0.01%的高锰酸钾溶液消毒0.5 h取出毁髓，φ为70%的酒精消毒鱼体后移入超净工作台。用已消毒好的手术剪剪开罗非鱼一侧腹腔，小心取出肝脏，用预冷的DMEM/F12培养液清洗3次，将肝组织剪成约1 mm3左右的组织块，清洗3次后转入含有 φ 为0.05%胶原酶的培养瓶中，26 ℃水浴中消化10 min，充分吹打，200目滤网过滤去除碎块，1 500 r·min–1冷冻离心2 min，收集肝细胞，再以900 r·min–1冷冻离心2 min以去除混杂在肝细胞中的杂细胞。细胞以DMEM/F12培养液重悬后，计数细胞密度，使其达到5×105个·mL–1，随后接种于多个24孔细胞培养板(美国Corning)，在 φ(CO2)为5%的26 ℃培养箱中培养。
1.3 GSH处理肝细胞培养48 h后，吸出培养液并用Hank氏液清洗，分别加入含有φ为10%胎牛血清和不含胎牛血清的DMEM/F12培养液，在2种培养液中加入GSH，使其终质量浓度为30、100、300和900 mg·L–1，不加入GSH组为对照组，每个水平设6个重复。在培养24、48和72 h后，分别测定肝细胞的增殖情况，随后以1 800 r·min–1离心5 min，取培养液上清，分装于0.5 mL的离心管中，保存于–20 ℃冰箱中以备分析。
1.4 测定方法肝细胞的增殖采用MTT法[11]测定，测得的光密度(D490 nm)与活细胞的数目具有良好的相关性；IGF-1的测定采用放射免疫测定法，样品的前处理采用酸醇提取法[12]，具体操作参照测定试剂盒(天津九鼎医学生物工程公司)说明书进行。由于测定试剂盒为人医研制，硬骨鱼类的和人类的IGF-1氨基酸序列有近80%的相似性[13]，因此，经逐级稀释罗非鱼血清样品后测定IGF-1含量，得出血清浓度与样品IGF-1含量的回归方程为：y=0.122x–1.921 6, R2=0.958 9，确定该试剂盒可用于测定罗非鱼样品IGF-1的含量。上清液中白蛋白含量测定采用溴甲酚绿比色法，谷草转氨酶(Glutamate-oxaloacetate transaminase，GOT)活性测定采用赖氏法，γ–谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT)和过氧化氢含量均采用试剂盒测定(南京建成生物工程研究所)。谷草转氨酶和γ–谷氨酰转肽酶活性用U表示，其代表1分钟内转化1 μmol底物所需的酶量。
1.5 数据统计分析采用SPSS20.0统计软件对数据进行统计和方差分析。数据采用平均数±标准误表示，组间数据经方差分析后有显著差异再做Duncan’s多重比较。
2 结果与分析 2.1 罗非鱼肝细胞的形态无血清培养条件下，培养24和48 h 后经GSH处理的肝细胞生长情况比未经GSH处理的细胞折光性好，但各处理组间肝细胞形态没有明显差别。在72 h后添加900 mg·L–1GSH的肝细胞生长状况最好，未见细胞连成网状及从培养板底部脱落的现象，而此时对照组有大量细胞从培养板底部脱落。添加血清培养条件下，肝细胞在各时间段生长情况良好，组间形态差别不明显。
2.2 罗非鱼肝细胞的增殖如表1所示，无血清培养条件下，在培养24、48和72 h后，经GSH处理的肝细胞增殖均显著高于对照组(P<0.05)；在72 h后，随着GSH的加入量增加，D490 nm显著增加，且各处理组间均有显著差异。添加血清培养条件下，在24 h后添加300、900 mg·L–1 GSH组肝细胞增殖显著高于其他各组，在48 h 后添加300 mg·L–1 GSH组肝细胞增殖显著高于其他各组，在72 h后添加300、900 mg·L–1GSH组肝细胞增殖显著高于对照组。
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表 1 不同培养时间罗非鱼肝细胞培养液的光密度(D490 nm) 1) Table 1 D490 nm value of tilapia hepatocyte culture after culturing for different time |
如表2所示，无血清培养条件下，在培养24、48和72 h后经GSH处理的肝细胞培养液中H2O2 含量显著低于对照组。添加血清培养条件下，在24 h后添加100、300和900 mg·L–1 GSH 组中 H2O2含量显著低于对照组，在48和72 h 后，各处理组肝细胞培养液中H2O2含量无显著差异(P>0.05)。
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表 2 不同培养时间肝细胞培养液中H2O2的含量1) Table 2 H2O2 content in hepatocyte culture after culturing for different time |
如表3所示，无血清培养条件下，在培养24 h后添加100和300 mg·L–1 GSH 组中 IGF-1 含量显著高于对照组，在48 h后添加300 mg·L–1 GSH 组中 IGF-1 含量显著高于各处理组，在72 h后添加900 mg·L–1 GSH 组中 IGF-1 含量显著高于对照组。添加血清培养条件下，在 24 h 后添加 100、300 和 900 mg·L–1 GSH 组中 IGF-1 含量显著高于对照组，在 48 和 72 h 后添加 300、900 mg·L–1 GSH 组中 IGF-1 含量均显著高于对照组。随着培养时间延续，各处理组培养液中 IGF-1 含量呈现升高的趋势。
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表 3 不同培养时间肝细胞培养液中IGF-1含量1) Table 3 IGF-1 content in hepatocyte culture after culturing for different time |
如表4所示，无血清培养条件下，在培养 24 h 后经 GSH 处理的各处理组间白蛋白含量无显著差异，在 48 h 后 300 mg·L–1组中白蛋白含量显著高于对照组，在 72 h 后添加 300 和 900 mg·L–1 GSH 组中白蛋白含量显著高于其他各组。添加血清培养条件下，在 24 和 72 h 后经 GSH 处理的各组间白蛋白含量无显著差异，在 48 h 后添加 100 和 300 mg·L–1 GSH 组中白蛋白含量显著高于其他各组。添加血清培养肝细胞培养液中白蛋白的含量明显高于无添加血清培养肝细胞培养液中白蛋白的含量。
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表 4 不同培养时间肝细胞培养液中白蛋白含量1) Table 4 Albumin content in hepatocyte culture after culturing for different time |
如表5所示，无血清培养条件下，在培养24 和48 h后添加100、300和900 mg·L–1GSH组中 γ-GT活性显著高于对照组和添加30 mg·L–1GSH组，在72 h后添加300和900 mg·L–1GSH组中 γ-GT活性显著高于对照组。添加血清培养条件下，在48 h后添加300 mg·L–1GSH组中 γ-GT活性显著高于对照组。
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表 5 不同培养时间肝细胞培养液中 γ-GT的活性1) Table 5 γ-GT activity in hepatocyte culture after culturing for different time |
如表6所示，无血清和添加血清培养条件下，经GSH处理的试验组各阶段GOT活性均随GSH增加而下降。
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表 6 不同培养时间肝细胞培养液中GOT的活性 1) Table 6 GOT activity in hepatocyte culture after culturing for different time |
GSH具有促进有丝分裂和调控细胞增殖的作用[14]，并可以清除细胞内过多的H2O2，调控自由基水平，间接影响DNA合成[15-17]。有研究表明，上皮纤维细胞(GM0868)培养液中加入GSH合成抑制剂能够降低上皮纤维细胞增殖，而加入GSH的前体物(氧化四氢噻唑羧基盐)能降低细胞自由基水平，促进上皮纤维细胞增殖[15]。本试验中，为排除血清中所含GSH的干扰，设置添加血清和未添加血清试验组，分析结果显示GSH均能促进罗非鱼肝细胞在体外增殖。GSH处理72 h后，无血清培养的细胞出现死亡现象，而此时添加900 mg·L–1 GSH 组的细胞数目最多，H2O2含量在GSH处理组亦显著低于对照组，说明GSH本身可以被吸收利用，促进细胞增殖，且可以降低H2O2含量[18]。因此，本试验结果用罗非鱼肝细胞印证了GSH的作用和作用机理。
3.2 GSH对体外培养罗非鱼肝细胞生化功能的影响肝脏具有合成和分泌IGF-1的功能[19]。本试验中，在添加血清和未添加血清试验组中GSH均能显著促进IGF-1分泌，且IGF-1分泌与肝细胞增殖表现出一致性。其中，添加血清培养时细胞的增殖和IGF-1的分泌明显高于无血清培养时，说明肝细胞在营养充足的情况下具有较高的IGF-1分泌能力[20]和增殖能力。
白蛋白由肝脏合成，作为脂肪酸运输载体，是反应肝功能的主要指标之一。本试验中未添加血清培养肝细胞时，肝细胞具有合成分泌白蛋白的能力，且随着培养时间延长，较高剂量的GSH处理能促进白蛋白的分泌。在添加血清培养肝细胞时，分泌的白蛋白的量仍远远高于无血清培养时，说明在无血清培养时，肝细胞合成分泌白蛋白的功能有所下降。
GSH的 γ–谷氨酰基可作为氨基酸转运的载体，参与小肠吸收的氨基酸从微绒毛细胞膜外转运到细胞内，此过程在 γ–谷氨酰基转移酶(γ-GT)催化下完成[21]。本研究表明，无血清培养时，随着GSH处理剂量增大，培养液中 γ-GT活性显著升高，说明 GSH 可增加肝细胞中 γ–谷氨酰基水平，提高细胞膜基质上的 γ-GT的活性，促进氨基酸的吸收。添加血清培养时，γ-GT的活性随着GSH处理剂量的增加有升高的趋势，仅GSH处理48 h后300 mg·L–1组 γ-GT 活性显著升高，说明在营养充足时GSH提高 γ-GT 活性的作用没有营养相对不足时强。
3.3 GSH对体外培养罗非鱼肝细胞的保护作用转氨酶主要存在于细胞内，在氨基酸代谢及蛋白质、脂肪、糖三者代谢转化过程中占有重要地位，当组织病变引起细胞膜的通透性增加，或细胞受到损伤时，细胞内的转氨酶才会大量释放出来。研究表明GSH具有保护肝脏的作用，在肝脏受到损伤后，可加快肝组织的恢复[22]。本试验中，无论是否有血清添加，罗非鱼肝细胞培养液中GOT活性均随 GSH 处理剂量的增加而下降，表明GSH对肝细胞有一定的保护作用，能防止肝细胞膜通透性增加，从而减少GOT释放到培养液中。
综上所述，本文从细胞水平揭示，GSH能够促进奥尼罗非鱼原代肝细胞分泌IGF-1和白蛋白，提高 γ-GT活性，降低H2O2含量和GOT活性，促进肝细胞增殖与生长，进一步地验证了GSH调控奥尼罗非鱼生长代谢的理论数据，为GSH在奥尼罗非鱼饲料的生产提供了技术支持。
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