放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，已知的微生物活性物质中70%以上来源于放线菌。对放线菌发酵产生的活性物质研究发现，胞内活性产物的分离纯化常面临高浓度反馈抑制、破碎菌体过程繁琐、易引入其他杂质等问题^[1]。表面活性剂能够有效促进微生物发酵获得活性物质^[2]，吴敏等^[3]通过添加表面活性剂改变了细胞膜通透性，减少了产物对细胞代谢的影响，冮洁等^[4]添加表面活性剂促进重组里氏木霉Trichoderma reesei 生物合成组织纤溶酶原激活物。有研究表明添加表面活性剂可以改变细胞膜的通透性，从而促进胞内物质的外排^[5-6]。

加利利链霉菌Streptomyces galilaeus为放线菌门Actinobacteria链霉菌科Streptomycetaceae链霉菌属Streptomyces，可以产生阿柔比星等蒽醌类抗肿瘤活性物质^[7-8]。华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室分离获得1株加利利链霉菌菌株AF1^[9]，前期研究发现AF1代谢物具有较好的抗菌活性，对路邓葡萄球菌-2363 Staphylococcus lugdunensis-2363、黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus等革兰阳性菌敏感和香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. cubense、芒果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides等植物病原真菌有效，对革兰阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)同样有效，但对革兰阴性菌不敏感，初步的抗菌机理研究发现，AF1代谢物能够杀灭静息革兰阳性菌细胞，与现有抗生素的抑菌作用机理有所不同^[10]。前期研究在提高加利利链霉菌AF1发酵效率方面进行了培养基的优化^[11]及接种方式的选择，研究过程中发现AF1菌株产生的抗菌活性物质只有部分分泌到胞外，还有部分在胞内积累，胞内抗菌活性物质占总抗菌活性物质的33%。

本文旨在探讨不同种类的表面活性剂对加利利链霉菌AF1发酵效率的影响，优化表面活性剂添加的种类、浓度和时间，减缓或消除胞内产物高浓度时的反馈抑制，从而提高抑菌活性物质的合成及胞外分泌量。

1 材料与方法 1.1 材料

加利利链霉菌AF1由华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室分离保存；MRSA购自广东省微生物菌种保藏中心。

高氏一号培养基：可溶性淀粉 20 g，KNO₃ 1 g，K₂HPO₄ 0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，水1 000 mL，固体培养基加琼脂 20 g。

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取粉 5 g，NaCl 10 g，水1 000 mL，固体培养基加琼脂 20 g。

非离子型表面活性剂：吐温–80(Tween-80)、曲拉通X–100(Triton X-100)、山梨醇。离子型表面活性剂：十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。特殊表面活性剂：CaCl₂、二甲基亚砜(DMSO)。以上表面活性剂皆为市售分析纯。

1.2 方法

1.2.1 培养条件　从高氏一号固体培养基上刮取培养7 d的加利利链霉菌 AF1 的成熟孢子于含有玻璃珠的无菌水中，180 r·min^–1摇床震荡30 min后采用血球计数板计算孢子数量，调配孢子悬浮液为5×10⁶ cfu·mL^–1，取悬浮液1 mL接种于100 mL的高氏一号培养基中，置于28 ℃ 摇床 220 r·min^–1培养8 d。

1.2.2 加利利链霉菌AF1抗菌活性的测定　取发酵液100 mL，6 000 r·min^–1离心 15 min取上清液，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压蒸干后用丙酮定容至1 mL，即待测胞外 (发酵液) 活性物质。

参照文献[12]中的方法，取离心后的菌体加水，经数显高速分散匀质机磨碎细胞，加乙酸乙酯萃取，静置10 min，待菌体碎片沉降至水相底部(萃取3次)，收集合并乙酸乙酯相，减压蒸干后用丙酮定容至1 mL，即待测胞内活性物质。

将灭菌后的固体LB培养基加热融化冷却至40~50 ℃，按2%(φ)的接种量，加入活化培养的MRSA菌液，混合均匀后倒入90 mm培养皿中，冷却凝固后，用9 mm打孔器打孔，在测定孔中加入待测溶液50 μL，置于37 ℃条件下培养，24 h后采用十字交叉法测量透明抗菌圈直径，试验重复3次。

1.2.3 表面活性剂对AF1菌株发酵液粗提物抗菌活性的影响　将吐温–80、山梨醇、DMSO、曲拉通X–100、CTAB、SDS、CaCl₂等表面活性剂分别加入到液体高氏一号培养基中，使得表面活性剂的质量浓度分别为0、0.5、2.0、4.0、8.0、10.0 g·L^–1，灭菌后按照1.2.1的方法接种培养，8 d后测定AF1菌株发酵液的抗菌活性，方法参照文献[13]。

1.2.4 表面活性剂添加时间、浓度的优化　选取的表面活性剂分别于发酵后1、3、5、7 d添加，持续发酵8 d后测定发酵液抗菌活性，试验重复3次。

采用3因素3水平响应面中心组合试验优化表面活性剂的添加质量浓度，方法参照文献[14-15]，试验因素及水平见表1。进行响应面模型的验证试验。

1.2.5 表面活性剂对AF1菌株细胞膜通透性的影响　AF1菌株培养5 d后，试验组按1.2.4的优化结果添加相应质量浓度的表面活性剂，继续培养至8 d；以不添加表面活性剂培养8 d的AF1菌株为空白对照(CK)。由于加利利链霉菌AF1在培养后期出现菌体团聚现象，分别取5 mL含菌球的发酵液于研钵中，轻轻研磨菌球团成浆后采用100 μm的细胞过滤器过滤。方法参照文献[16]，取2 mL滤液加入2 mmol·L^–1的亲脂性阴离子荧光染料双–(1, 3–二巴比妥酸)–三次甲基氧烯洛尔2 μL，28 ℃、180 r·min^–1震荡孵育30 min，采用BD-FACSCalibur流式细胞仪检测细胞荧光强度，试验重复3次。

1.3 数据处理

利用SPSS分析软件对试验数据进行差异显著性分析。参照文献[17]，利用“数据探索检验”检验出试验组和空白对照组(CK)的细胞荧光强度都符合正态分布，即这2个样本可进行独立t检验。

2 结果与分析 2.1 表面活性剂对AF1菌株发酵液粗提物抗菌活性的影响

表面活性剂对AF1菌株发酵液粗提物抗菌活性的影响见表2。表2结果表明：不同表面活性剂对AF1菌株发酵液的抗菌活性影响不同；相同表面活性剂在不同浓度下，AF1菌株发酵液的抗菌活性也表现出了一定的差异显著性，随活性剂添加量的增加，平均抑菌圈直径表现出先上升再下降的趋势，不同表面活性剂的初步最适添加浓度对AF1菌株抑菌圈直径的差异显著性分析见表3，确定了不同表面活性剂的初步最适添加浓度和种类。

2.2 表面活性剂添加时间的优化

将吐温–80、山梨醇、曲拉通X–100分别按照8、4、2 g·L^–1的初步最优添加量，分别于发酵1、3、5、7 d后添加，培养8 d后测定抑菌活性，结果见图1。图1表明，相同浓度的表面活性剂由于添加时间不同，AF1菌株发酵液的抑菌圈直径存在差异，3种表面活性剂的最优添加时间都是在发酵5 d后，AF1菌株发酵液的抑菌圈直径明显高于其他添加时间的抑菌圈直径，这可能因为培养前期添加表面活性剂抑制了菌体的生长，而发酵7 d后时添加，则表面活性剂与AF1菌株接触时间短，使得抗菌活性物质外排不明显，表现为抑菌圈直径小于5 d添加时的抑菌圈直径。

2.3 响应面试验

在单因素试验结果的基础上，选取吐温–80、曲拉通X–100、山梨醇分别为自变量X₁、X₂、X₃，以放线菌AF1发酵液抗菌圈直径为响应值(Y)进行响应面分析试验，结果见表4。

根据表4的试验结果，利用Design-Expert进行二次多项式拟合，得到以AF1菌株发酵液抑菌圈直径为响应值(Y)的回归方程：

Y =28.2+1.13X₁+0.25X₂–0.38X₃+1.25X₁X₂+0.25X₂X₃–2.60X₁²–2.85X₂²–3.10X₃²。

对回归模型进行方差分析，结果见表5，结果表明该模型极显著(P<0.000 1)，具有统计学意义，失拟项不显著(P=0.117 1>0.05)，该模型与试验的拟合度良好；该模型的决定系数R²=0.977 7，校正决定系数R²=0.948 9，表明该模型对因变量的解释程度达94.89%，即使用该方程模拟真实的3因素3水平的分析是可行的。由表5可以看出，方程中X₁、X₁X₂、X₁²、X₂²、X₃²对Y值的影响高度显著或极显著，表明试验因素对响应值(Y)不是简单的线性关系，不仅二次项对响应值有很大的影响，表现出极显著性，而且二次项系数为负，说明该方程有极大值，优化后的添加结果：吐温–80为8.95 g·L^–1、曲拉通X–100为2.09 g·L^–1、山梨醇为3.89 g·L^–1，理论抑菌圈直径为28.35 mm。

图2、图3、图4分别代表2个独立变量间的相互作用，其余变量保持在中心水平的响应面3D直观图及等高线图。

图2结果表明：保持山梨醇添加浓度不变的情况下，在一定范围内，提高吐温–80和曲拉通X–100的添加浓度，AF1菌株发酵液抑菌圈直径不断增大，到达最高点后又逐渐开始下降，呈现出低浓度促进，高浓度抑制的效果，这是因为低浓度的表面活性剂可提高细胞膜通透性，而高浓度的表面活性剂则会破坏细胞结构，甚至导致菌体破裂死亡。

图3结果表明：保持曲拉通X–100添加浓度不变的情况下，在一定范围内，提高吐温–80和山梨醇的添加浓度，AF1菌株发酵液抑菌圈直径不断增大，到达极值点后又开始逐渐下降，这是因为表面活性剂可以增加细胞膜通透性，但是浓度太高则会导致细胞膜破裂甚至死亡，所以表面活性剂对细胞生长代谢的促进具有最适浓度。

图4结果表明：保持吐温–80添加浓度不变的情况下，在一定范围内，提高曲拉通X–100和山梨醇的添加浓度，AF1菌株发酵液抑菌圈直径不断增大，到达极值点后又开始逐渐下降，这是因为低浓度的表面活性剂对AF1菌株细胞膜通透性的提高效果不明显，抑菌物质外排有限，导致高浓度的反馈抑制，影响AF1菌株抗菌物质的合成。高浓度的表面活性剂导致细胞膜变形甚至破裂，进而影响AF1菌株发酵合成抗菌活性物质。

为了验证响应面模型的可行性，采用最佳的表面活性剂添加质量浓度进行摇瓶试验。培养加利利链霉菌AF1菌株5 d时添加吐温–80、曲拉通X–100和山梨醇，使其质量浓度分别为8.95、2.09和3.89 g·L^–1，发酵8 d后测定AF1发酵液的抑菌圈直径，设置3组平行试验，试验测得抑菌圈平均直径为27.67 mm，比理论值小2.4%。说明可以使用该响应面模型对加利利链霉菌AF1发酵液抗菌活性进行优化。

2.4 表面活性剂对细胞膜通透性的影响

采用BD-FACSCalibur流式细胞仪测定AF1菌株的细胞荧光强度，对试验组和空白对照组(CK)的细胞荧光强度利用SPSS分析软件进行独立t检验，结果见表6和表7。

从表7可以看出，2组方差不显著，所以应选择“假设方差相等”行的数据作为分析结果。t值为–14.59，Sig. 双侧t检验的显著性概率为0，小于0.05，故2组数据差异显著，即试验组的细胞荧光强度显著高于空白对照组的细胞荧光强度。由于荧光染料本身是1种没有荧光的阴离子亲脂性染料，只有进入到细胞内部，与胞浆内的蛋白质结合才会发出荧光^[18]，因此试验组的细胞膜通透性显著高于空白对照组，说明添加表面活性剂可以显著提高加利利链霉菌AF1的细胞膜通透性，有利于活性物质的外排，降低抑菌活性物质的胞内反馈机制，提高了放线菌AF1抑菌活性物质的生物合成量，为加利利链霉菌AF1活性物质的生产及分离纯化奠定了基础。

3 讨论与结论

Huchenq等^[19]研究发现表面活性剂可以抑制细胞膜中脂肪酸的合成，进而改变细胞膜的构造及通透性，使得微生物次级代谢产物更容易渗透到胞外，减缓或消除胞内的高浓度抑制效果，同时也更利于营养物质的传递，从而提高次级代谢产物的合成量。Reddy等^[20]发现表面活性剂曲拉通X–100对耐热梭状芽孢杆菌Clostridium thermosulfurogenes SV2菌体的生长具有一定的抑制作用，但是可显著提高其耐热性β–淀粉酶和支链淀粉酶的产量。Ebune等^[21]在研究曲霉Aspergillus ficuum发酵产生植酸酶的过程中发现添加吐温–80可以提高曲霉发酵产植酸酶的效率，而加入曲拉通X–100则不利于植酸酶的产生，罗玮^[22]研究重组大肠埃希菌Escherichia coli生产L–色氨酸时发现在发酵前期添加吐温–60能够促进L–色氨酸的过量合成，原因为吐温–60和细胞接触时间较长，充分影响细胞膜通透性及代谢流分布。本研究也得到了类似的结果，添加表面活性剂影响了加利利链霉菌AF1的生长和代谢产物的合成，同属非离子型的表面活性剂也因其结构、性质和浓度的不同而影响加利利链霉菌AF1的发酵代谢，其中浓度效应表现出高浓度抑制、低浓度促进的现象，添加时间的不同也对加利利链霉菌AF1的发酵产生影响。根据单因素试验结果得知吐温–80、曲拉通X–100和山梨醇对加利利链霉菌AF1发酵效率的提高最为显著，响应面试验优化表明在发酵5 d后，添加8.95 g·L^–1吐温–80、2.09 g·L^–1曲拉通X–100、3.89 g·L^–1山梨醇，持续发酵至8 d后，发酵液抑菌圈直径为27.67 mm，比优化前效果提高了25.45%。