2018, Vol. 39
, 土壤氮素转化相关微生物是构成稻田氮循环的关键环节，其数量会受到土壤灌水方式与施肥的影响[1]，但不同微生物对土壤环境改变的敏感程度不同[2]。研究表明，在有水层条件下，土壤亚硝酸细菌和硝酸细菌生长缓慢，而反硝化细菌能够生长较快；干湿交替初期刺激反硝化细菌数量增长，硝化细菌数量降低[3]。“薄浅湿晒”灌溉方式土壤硝化细菌数量较常规灌溉方式有所增加，而反硝化细菌数量有所下降[4]。长期单施化肥或NPK肥均衡施用土壤硝化细菌数量较不施肥土壤增加，而土壤反硝化细菌数量减少；NPK配施秸秆或有机肥较单施化肥、非均衡施肥或撂荒土壤硝化、反硝化细菌数量均显著增加[5-6]。
土壤氮素转化相关酶活性可以反映土壤氮素转化与供给状况[7]，也受灌水方式和施肥等因素影响[8]。脲酶促使尿素水解为氨和二氧化碳[9]，其活性可以表征土壤无机氮供应能力。硝酸还原酶和亚硝酸还原酶是土壤反硝化作用中的2种关键性还原酶(反硝化酶)，其活性大小体现了土壤反硝化能力的强弱[9]。羟胺还原酶是土壤硝态氮同化还原为铵的中间产物酶，可将中间产物NH2OH还原成NH3—OH[8]，其活性大小与土壤氨挥发和N2O排放有关。以往研究指出，与常规灌溉相比，控制灌溉和间歇灌溉可提高土壤脲酶活性[10]，反硝化酶活性随干旱–复湿的进行呈现“脉冲”式变化，但在淹水或恒湿条件下其活性较大[11]。土壤高含水量情况下，硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性均较高，而羟胺还原酶活性较低[12]。有关有机无机肥配施对土壤酶活性的影响报道较多，有机肥的施入可显著提高氮素转化酶活性，且有机肥结合化肥施用效果最佳[13-14]。
“薄浅湿晒”和干湿交替灌溉技术是我国南方地区应用较广的稻田节水灌溉方式[15-16]，通过调节水稻不同生育期灌水量，达到提高水稻产量和水分利用效率的目的。但由于这2种灌溉方式下不同时期土壤水分不同，土壤通气状况相应变化，从而土壤氮素转化相关微生物活性将受到影响。且在有机肥替代化肥条件下，“薄浅湿晒”和干湿交替灌溉对水稻不同生育期土壤氮素转化相关微生物数量与酶活性的影响研究较少，有待探明这2种灌溉方式稻田氮素转化相关微生物活性的变化规律。因此，本文在不同尿素猪粪比例下，研究不同灌溉方式对水稻不同生育时期土壤氮素转化相关的亚硝酸细菌、硝酸细菌和反硝化细菌数量以及脲酶、羟胺还原酶、亚硝酸还原酶和硝酸还原酶活性的影响，并分析土壤各微生物活性指标之间的关系，以揭示“薄浅湿晒”和干湿交替灌溉下的稻田氮素转化相关微生物活性的变化规律。
1 材料与方法 1.1 试验材料盆栽试验在广西大学农业资源与环境系网室内进行。供试土壤为第四纪红色黏土发育的赤红壤，风干、粉碎、过10 mm筛备用，土壤pH 6.41，有机质17.36 g·kg–1，碱解氮114.6 mg·kg–1(1 mol·L–1NaOH碱解扩散法)，速效磷35.9 mg·kg–1(0.5 mol·L–1 NaHCO3，钼蓝比色法)和速效钾89.2 mg·kg–1(1 mol·L–1中性NH4Ac法提取，火焰光度计法测定)。供试有机肥为腐熟猪粪，其全N、P2O5、K2O和有机质质量分数分别为0.53%、0.49%、0.37%和14.87%(干基)，水分含量(w)为71.23%。试验尿素为w(N)=46%，过磷酸钙为w(P2O5)=12%，氯化钾为w(K2O)=60%。供试水稻Oryza sativa品种为‘Y两优3218’。试验盆钵规格：上部直径38 cm，下部直径35 cm，高40 cm；每盆称取上述土壤20.0 kg拌匀基肥于桶内，装盆后淹水3 d(20~30 mm水层)。盆底没有排水孔，故没有水分排出。
1.2 试验方法盆栽试验设3种灌溉模式，即常规灌溉(CIR)：移栽返青期、分蘖期到乳熟期盆内均保持25~30 mm水层左右，分蘖末期和成熟期仅保持土壤湿润；干湿交替灌溉(DIR)：参照张自常等[17]的方法，移栽后7 d内盆内保持20 mm左右水层，而后进行干湿交替灌溉，即当土壤水势为−15 kPa(用张力计TEN45监测，南京土壤研究所工厂)时，灌水至20 mm，如此循环，至水稻成熟结束；“薄浅湿晒”灌溉(TIR)：参照梁燕菲等[4]的方法。3种施氮处理为FM1(全尿素)、FM2(猪粪替代30%尿素)和FM3(猪粪替代50%尿素)，所有处理N、P2O5和K2O用量相同，分别为0.150、0.075和0.150 g·kg–1，其中FM1不施猪粪，FM2每盆施猪粪169.8 g，FM3每盆施猪粪283.0 g。全部磷肥和猪粪，部分尿素、氯化钾作基肥施入，装盆时与土壤充分混匀，其中FM1施入50%的尿素和氯化钾，FM2施入全部猪粪和20%尿素N，以及FM3施入全部猪粪，根据有机肥中钾用量，用氯化钾补足作基肥，余下50%的尿素和氯化钾分别以分蘖肥(移栽后15 d)和穗肥(移栽后55 d)均按25%的比例施入。试验共9个处理，每处理3个重复，共27盆，随机排列。
试验于2014年6月13日播种，水稻催芽露白后，培育至三叶一心期，选取长势一致的幼苗于7月10日移栽，每盆3穴，1穴1株，移栽深度2~3 cm。秧苗移栽前所有盆内土壤均保持浅水层(20~30 mm)。不同灌水处理从7月16日秧苗返青后进行，至10月20日水稻黄熟后结束，10月23日全部收获完毕，全生育期132 d。此外，试验期间其他农学管理措施一致。
1.3 土壤采集与测定在分蘖期(7月26日，移栽后16 d)、孕穗期(8月30日，移栽后51 d)、乳熟期(9月20日，移栽后72 d)与成熟期(10月13日，移栽后95 d)采集土样，每次采样时间为灌水处理后的次日上午，分别采集不同处理0~20 cm土层土壤并混匀，装入保鲜袋，迅速带回实验室，用于测定微生物数量、酶活性，不能及时处理的部分土壤于冰箱4 ℃条件下保存，1周内完成测定。同时用烘干法测定土壤含水率，以便计算每克干土中土壤微生物数量和酶活性。
土壤亚硝酸细菌、硝酸细菌和反硝化细菌培养基配方见表1，均用MPN计数法测定。亚硝酸细菌数量用Griess试剂进行检测，硝酸细菌数量用二苯胺试剂检测，反硝化细菌数量用奈氏试剂、格利斯试剂和二苯胺试剂结合检测[9]。脲酶活性用苯酚–次氯酸钠测定[18]，羟胺还原酶活性用硫酸亚铁邻菲罗啉法测定[19]，硝酸还原酶活性用酚二磺酸比色法测定[20]，亚硝酸还原酶活性用格里试剂显色与酶促反应前后NO2–－N变化表征[6]。
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表 1 不同微生物培养基配方 Table 1 The medium formulas of different microorganisms |
试验所有数据均采用Excel2003和SPSS17.0软件进行分析，不同处理各指标平均值的比较采用Duncan’s新复极差法。
2 结果与分析 2.1 土壤硝化和反硝化细菌数量2.1.1 亚硝酸细菌数量 表2表明，不同处理土壤亚硝酸细菌数量以孕穗期较多，其他时期数量较少。在分蘖期DIR土壤亚硝酸细菌平均数量为25.62×103 g–1，显著高于CIR和TIR；全尿素(FM1)处理下乳熟期TIR土壤亚硝酸细菌数量为18.51×103 g–1，较CIR和DIR分别多109.63%和83.27%，且差异显著；FM2处理下TIR与DIR土壤亚硝酸细菌数量在乳熟期显著高于CIR，成熟期显著低于CIR；FM3处理下孕穗期和乳熟期TIR土壤亚硝酸细菌数量均显著高于CIR，成熟期DIR土壤亚硝酸细菌数量显著低于CIR和TIR。相同灌溉方式下，DIR的分蘖期FM3处理土壤亚硝酸细菌数量(21.56×103 g–1)，显著低于FM1和FM2，而在孕穗期(40.23×103 g–1)，显著高于FM1和FM2；孕穗期TIR灌溉方式下FM3处理的土壤亚硝酸细菌数量为37.96×103 g–1，较FM1增加53.68%，乳熟期各灌溉方式下FM1处理的土壤亚硝酸细菌数量均显著低于FM3，成熟期CIR和TIR灌溉方式下FM3处理的土壤亚硝酸细菌数量显著高于FM1。
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表 2 灌溉方式和施氮处理对土壤亚硝酸细菌数量的影响 Table 2 Effect of irrigation method and N treatment on the number of nitrite bacteria in soil |
2.1.2 硝酸细菌数量 表3表明，不同处理土壤硝酸细菌数量也以孕穗期较多，其他时期数量较少。分蘖期至乳熟期，相同施氮处理下DIR和TIR土壤硝酸细菌数量高于CIR，成熟期FM1处理下DIR和TIR土壤硝酸细菌数量分别为1.80×103和2.22×103 g–1，显著低于CIR，而FM2和FM3处理下3种灌溉方式土壤硝酸细菌数量之间的差异均不显著。相同灌溉方式下，DIR的分蘖期FM1的土壤硝酸细菌数量达7.03×103 g–1，较FM2和FM3分别多38.11%和94.67%，且差异显著，而在孕穗期和成熟期显著低于FM2和FM3。CIR和TIR灌溉方式下4个采样时期土壤硝酸细菌数量受施氮处理的影响多数不显著。
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表 3 灌溉方式和施氮处理对土壤硝酸细菌数量的影响 Table 3 Effect of irrigation method and N treatment on the number of nitrifying bacteria in soil |
2.1.3 反硝化细菌数量 不同处理土壤反硝化细菌数量以孕穗期较多，成熟期较少(表4)。相同施氮处理下，DIR处理4个时期土壤反硝化细菌数量低于相应的CIR处理，成熟期TIR土壤反硝化细菌平均数量为18.32×104 g–1，显著低于CIR方式(30.44×104 g–1)。相同灌溉方式下，分蘖期猪粪代替尿素处理对土壤反硝化细菌数量提高作用显著，与FM1相比，CIR、DIR和TIR方式下FM2处理的土壤反硝化细菌数量分别提高86.68%、40.13%和62.99%，FM3处理分别提高144.96%，86.33%和146.99%；此外，与FM1相比，CIR方式下FM3处理也能够显著提高孕穗期、乳熟期和成熟期土壤反硝化细菌数量，而DIR和TIR方式下FM3处理仅显著提高成熟期土壤反硝化细菌数量(表4)。
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表 4 灌溉方式和施氮处理对土壤反硝化细菌数量的影响 Table 4 Effect of irrigation method and N treatment on the number of denitrifying bacteria in soil |
2.2.1 脲酶活性 表5表明，不同处理土壤脲酶活性也以孕穗期较高，其他时期相对较低。与CIR相比，DIR和TIR方式可提高分蘖期至乳熟期土壤脲酶活性，而在成熟期各灌溉方式的土壤脲酶活性差异不显著。相同灌溉方式下，与FM1相比，TIR方式下的FM2处理在孕穗期(1.12 mg·kg–1·d–1)和FM3处理在乳熟期(0.92 mg·kg–1·d–1)，DIR方式下的FM2处理在分蘖期(0.76 mg·kg–1·d–1)、FM3处理在乳熟期(0.68 mg·kg–1·d–1)和成熟期(0.43 mg·kg–1·d–1)均能显著提高土壤脲酶活性，其他条件下不同施氮处理的土壤脲酶活性之间差异不显著。
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表 5 灌溉方式和施氮处理对土壤脲酶活性的影响 Table 5 Effect of irrigation method and N treatment on soil urease activity |
2.2.2 羟胺还原酶活性 表6表明，CIR和TIR灌溉方式下，各施氮处理的土壤羟胺还原酶活性在分蘖期至乳熟期极低，而在成熟期显著提高；DIR方式下的土壤羟胺还原酶活性在4个时期均较高，以孕穗期最高，平均活性为111.72 mg·g–1·d–1。相同施氮处理下，在分蘖期至乳熟期，DIR方式下的土壤羟胺还原酶活性显著高于CIR和TIR，而后两者之间差异不显著，在成熟期，土壤羟胺还原酶活性也差异不显著。相同灌溉方式下，CIR和TIR方式下仅在成熟期出现猪粪代替尿素处理土壤羟胺还原酶活性高于纯尿素处理的现象；DIR灌溉方式下，在分蘖期FM2和FM3处理的土壤羟胺还原酶活性分别为49.55和42.62 mg·g–1·d–1，较FM1处理(36.22 mg·g–1·d–1)分别提高36.79%和17.67%，在孕穗期FM3处理的土壤羟胺还原酶活性(124.00 mg·g–1·d–1)，较FM2处理(100.59 mg·g–1·d–1)提高23.27%，在乳熟期FM3处理的土壤羟胺还原酶活性(89.47 mg·g–1·d–1)，较FM1处理(72.54 mg·g–1·d–1)提高23.34%，差异均达到显著水平。
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表 6 灌溉方式和施氮处理对土壤羟胺还原酶活性的影响 Table 6 Effect of irrigation method and N treatment on soil hydroxylamine reductase activity |
2.2.3 亚硝酸还原酶活性 表7表明，各处理的土壤亚硝酸还原酶在分蘖期至乳熟期活性较高，成熟期活性下降。相同施氮处理下，与CIR相比，在分蘖期至乳熟期DIR灌溉方式显著提高土壤亚硝酸还原酶活性，TIR与CIR灌溉方式的土壤亚硝酸还原酶活性差异多数不显著。与FM1相比，CIR方式下乳熟期FM3以及成熟期FM3和FM2处理显著提高土壤亚硝酸还原酶活性；与FMI相比DIR方式下分蘖期FM2和FM3、孕穗期FM3、乳熟期和成熟期FM2处理均显著提高土壤亚硝酸还原酶活性；与FMI相比，TIR方式下成熟期FM2和FM3处理显著提高了土壤亚硝酸还原酶活性。
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表 7 灌溉方式和施氮处理对土壤亚硝酸还原酶活性的影响 Table 7 Effect of irrigation method and N treatment on soil nitrite reductase activity |
2.2.4 硝酸还原酶活性 表8表明，不同处理土壤硝酸还原酶活性也表现为在孕穗期前上升，随后下降。相同施氮处理下，分蘖期至乳熟期，DIR较CIR灌溉方式显著降低土壤硝酸还原酶活性，TIR与CIR灌溉方式的土壤硝酸还原酶活性多数差异不显著。相同灌溉方式下，与FM1相比，DIR方式的乳熟期FM3处理、TIR方式的孕穗期至成熟期FM3处理及成熟期FM2处理、CIR方式的成熟期FM2和FM3处理均显著提高了土壤硝酸还原酶活性。
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表 8 灌溉方式和施氮处理对土壤硝酸还原酶活性的影响 Table 8 Effect of irrigation method and N treatment on soil nitrate reductase activity |
表9是各微生物活性指标之间的相关系数。除硝酸还原酶活性与硝酸细菌数量和亚硝酸还原酶活性之间的关系不显著外，其他指标之间的关系呈现显著或极显著正相关或负相关，说明这些指标是相互联系的。
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表 9 各微生物活性指标间的相关系数1) Table 9 Relationships among different indexes of microbial activities |
孕穗期是水稻生长的旺盛时期，该时期植株通气组织发达、根系泌氧功能完善，且根系生长在盆内有限的空间中，提高了根际环境比例，因而本研究孕穗期土壤硝化细菌数量增加；同时根系代谢产生的分泌物和脱落物增加了土壤碳源[21]，是本研究孕穗期反硝化细菌数量较高的原因；作物旺长期有利于土壤微生物胞外脲酶的产生和活性的提高[22]，这是本研究孕穗期脲酶活性较高的原因。本研究中，孕穗期土壤硝酸还原酶活性较高可能与该时期根系大量泌氧导致硝化作用加剧有关。亚硝酸还原酶多为胞内酶，可由NO2–诱导产生，以消除其累积毒害效应[23]。由于淹水条件下NO2–来源于硝酸还原酶的还原，所以两者活性受生育期的影响较为一致。羟胺还原酶与硝态氮的还原途径有关系[24]，不同生育期水分管理是造成其生育期羟胺还原酶活性差异的因素。
不同灌溉方式直接影响土壤水分含量和通气性。DIR方式的灌水层薄、部分时期无水层，对硝化细菌的生长有利，因此其数量在分蘖期和孕穗期较CIR方式显著增加。淹水处理对反硝化细菌的影响不显著，但DIR方式落干时段表层土壤反硝化细菌死亡[25]，因而其数量较低。良好的通气条件加速土壤矿质营养的释放，同时落干–复水过程使得硝化作用和反硝化作用频繁交替发生会造成土壤氮素过度损失，在固定施肥量的盆栽试验中易导致水稻生育中后期养分不足，这可能是DIR方式下乳熟期和成熟期微生物数量下降的原因。与此不同的是，CIR和TIR方式较长时期处于淹水状态，有机物分解缓慢，同时抑制好氧微生物增加，以减弱其对养分的竞争，到乳熟期或成熟期进行湿润、落干处理时矿化量增加，释放出养分，各项微生物数量指标较DIR均有所提高。DIR和TIR较CIR方式通气条件好，可改善微生物生长环境，利于脲酶活性的提高[26]。相同施氮处理下，与CIR相比，DIR方式下的土壤硝酸还原酶活性除成熟期外其余时期显著降低，表明淹水处理较干湿交替处理存在活性更强的硝酸还原酶，这与以往研究结果一致[27-28]。本试验显示，DIR方式下的土壤羟胺还原酶和亚硝酸还原酶活性同时较高，且大部分时期显著高于相同施肥条件下的CIR与TIR方式。亚硝酸还原酶是在好气条件中催化NO2-还原形成NH2OH(同化反硝化作用)，以及厌氧条件下催化其还原形成N2O或N2(异化反硝化作用)的中间酶[29]。因此，在CIR与TIR方式下的淹水期间，NO2-难以被还原形成NH2OH诱导产生相应的羟胺还原酶，可能是导致其活性低的主要原因。
施肥主要通过养分的释放与供给或刺激作物生长来直接或间接影响土壤微生物的活性。尿素氮释放迅速是造成DIR方式下分蘖期FM1处理土壤硝化细菌数量显著高于其他处理的主要原因。与尿素氮相比，猪粪矿化缓慢且分解过程消耗氧气加剧厌氧环境，抑制了硝化细菌数量的增加，但猪粪为反硝化细菌提供了丰富的碳、氮源，造成其数量显著增加，因此，分蘖期FM2和FM3处理的土壤硝化细菌数量较少，而反硝化细菌数量较多和硝酸还原酶活性较高。同时猪粪中本身存在一定数量的脲酶，可能是导致FM2和FM3处理脲酶活性较尿素处理高的一个因素[30]。但本研究CIR方式下分蘖期FM3处理的土壤脲酶活性显著低于FM1和FM2，可能与淹水条件下土壤中有机物质累积，腐殖质与土壤酶复合处于物理性保护状态[31]，使其活性相对稳定有关[32]。生育中后期，猪粪养分的释放提供了持续的氮素供应，有利于土壤微生物活性的保持，因此FM2和FM3处理的多数微生物指标显著高于FM1。此外，持续的氮素供应增加了土壤落干时硝化作用所需的NH4+，为复水后反硝化作用形成了更多的NO3–，易造成土壤氮素的损失。
本试验结果显示，稻田氮素转化各微生物数量及酶活性在水稻孕穗期较高；与常规灌溉相比，干湿交替提高分蘖期和孕穗期大部分土壤氮素相关微生物数量及酶活性，降低反硝化细菌数量和硝酸还原酶活性；“薄浅湿晒”和50%猪粪代替尿素处理对乳熟期和成熟期土壤氮素转化微生物活性提高作用明显。
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