2018, Vol. 39
2. 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，广西 南宁 530007;
3. 广西现代农业科技示范园，广西 南宁 530007;
4. 广西农业科学院 蔬菜研究所，广西 南宁 530007;
5. 广西农业科学院 生物研究所，广西 南宁 530007
2. Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Laboratory, Nanning 530007, China;
3. Guangxi Demonstration Park for Modern Agricultural Science and Technology, Nanning 530007, China;
4. Vegetable Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Science, Nanning 530007, China;
5. Biotechnology Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Science, Nanning 530007, China
同源四倍体黑皮冬瓜Benincasa hispida (Thunb.) Cogn.存在明显的自交低稔性[1]。Hakansson[2-3]认为，同源四倍体低稔性的原因应从受精前后来寻找。受精前同源四倍体作物花粉育性低、花粉管生长缓慢是低稔性的原因之一[4-6]。花粉的育性与花粉母细胞减数分裂存在相关性[7]。由于同源四倍体的染色体的同质性，花粉母细胞减数分裂时产生了大量单价体和三价体，使染色体分配不均，产生活力低或者无活力的雄配子，最终引起低稔性[8]。因此，花粉母细胞减数分裂异常是改变四倍体育性的细胞遗传因素得到学者的认同[9-10]，相继在同源四倍体西瓜[11]、水稻[6, 12]、萝卜[13]、青花菜[14]、甜瓜[15]、黄瓜[16]、芜菁[17]、白菜[18]、桑[19]、百合[20]、蝴蝶兰[21]等植物上有相关报道。而大量的研究表明，內源激素在花粉的育性、花粉管的生长及亲和性授粉受精等方面发挥重要作用[22-27]。魏琼等[28]研究指出，低结实性的四倍体水稻花粉活力低、结实率低是由于花粉中的吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid, IAA)、赤霉素(Gibberellin, GA)、玉米素核苷(Zeatin riboside，ZR)含量较低，而脱落酸(Abscisic acid, ABA)含量偏高引起的。谭素英等[29]研究指出，引起同源四倍体西瓜花粉萌发率低，花粉管生长缓慢且在生长过程中出现多种畸形，是由于四倍体西瓜花粉中的ZR含量过高及花粉与柱头中的(IAA+GA3)/ABA比值过低引起的。综上研究结果表明：受精前引起同源四倍体作物花粉育性低的原因除了花粉母细胞减数分裂外，还有内源激素的作用。那么在同源四倍体黑皮冬瓜上其内源激素与花粉育性、花粉管生长情况的关系如何呢？本研究以同源四倍体及其原二倍体黑皮冬瓜为试材，拟从其自交花粉萌发生长情况及花粉与雌蕊中内源激素含量进行比较分析，旨在阐明花粉的萌发生长与内源激素的关系，期待为同源四倍体黑皮冬瓜自交低稔性机理研究开拓新的研究思路。
1 材料与方法 1.1 试验材料同源四倍体(6-4×)及其原二倍体(6-2×)黑皮冬瓜材料由广西现代农业科技示范园提供。于2013年8月10日播种，9月1日按株行距3 m×2 m定植于4 个长30.0 m、宽6.5 m的单栋简易塑料大棚，采用单蔓单瓜常规整枝方式进行管理。同源四倍体(6-4×)是通过秋水仙素处理原二倍体(6-2×)获得，并自交7代。
1.2 试验方法 1.2.1 同源四倍体及其原二倍体黑皮冬瓜自交花粉在雌蕊上萌发与花粉管在花柱中生长情况观察参照胡适宜[30]、谭素英等[4]的方法略有改良。授粉前1天，将次日即将开放的雌雄花分别套袋。于次日07:00—10:00人工自交授粉，授粉后套住已完成授粉的雌花，做好标记。于授粉后0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0和12.0 h分别摘取2×襈、4×襈冬瓜雌蕊各5枚置于FAA固定液中保存备用。观察时取出雌蕊依次经过φ为70%、70%、50%、30%的乙醇溶液和蒸馏水清洗(各30 min)，然后用5 mol·L–1氢氧化钠溶液软化10 min，蒸馏水清洗3 次，剥离出柱头置于载玻片上，加1 g·L–1的苯胺蓝染色液，盖上玻片在显微镜Olympus IX51下观察并拍照。在授粉后0.5~3.0 h内随机选取20个视野统计花粉萌发率，重复3次。随机选取20个已萌发花粉粒，测定花粉管的生长长度(mm)，统计单位时间内花粉管生长长度即为花粉管的生长速度(mm·h–1)，重复3次。
花粉萌发率=视野中萌发的花粉粒数/该视野总的花粉粒数×100%。
1.2.2 同源四倍体及其原二倍体黑皮冬瓜花粉及雌蕊內源激素含量测定在开花期晴天08:00左右，分别混合收集当天开放的同源四倍体及其原二倍体黑皮冬瓜花粉各5 g，采集15个同源四倍体及其原二倍体黑皮冬瓜套袋未授粉的雌蕊(柱头和花柱)，用液氮速冻，置于–80 ℃冰箱保存备用。按0.1 g样品加入0.9 mL PBS缓冲液，分别各取花粉、雌蕊材料加入0.01 mol·L–1PBS缓冲液(pH=7.4)，研磨为匀浆，转移至1 mL离心管中。在12 000 r·min–1下离心10 min，收集上清液定容至1 mL，上清液即为内源激素提取液。使用上海时代生物科技有限公司提供的植物激素酶联免疫分析试剂盒，参照试剂盒使用说明测定生长素(IAA)、赤霉素(GA3)、玉米素核苷(ZR)、异戊烯基腺苷(Isopentenyl adenosine, IPA)和脱落酸(ABA)含量，各内源激素均重复测定5次。
1.3 数据统计与分析用EXCEL2003进行统计，用SPSS18.0软件进行独立样本t检验。
2 结果与分析 2.1 同源四倍体及其原二倍体黑皮冬瓜自交花粉在柱头上萌发及花粉管生长情况由图1可知，二、四倍体花粉的形态与萌发率存在显著差异。二倍体花粉表现为体积较小，大小均匀、整齐一致，呈规则的圆球形(图1A)；而四倍体花粉则比二倍体大，不整齐，呈圆球形、扁形、三角形或凹陷状等多种形态(图1B、1C)。经过人工辅助授粉后，花粉开始逐渐在雌蕊柱头上萌发。由表1可知，授粉0.5 h后，二倍体自交花粉开始有少量萌发，而四倍体花粉尚未见萌发。随授粉时间的后延，二、四倍体花粉萌发率均呈上升趋势，均在授粉后3.0 h萌发率达到最高，之后花粉萌发基本停止。在自交授粉各时期，二倍体的花粉萌发率均显著高于同源四倍体，在授粉后3.0 h时，二倍体自交花粉在柱头上的萌发率达最高为91.10%，而同源四倍体自交花粉萌发率仅为62.04%。
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图 1 花粉原位萌发及花粉管生长情况的显微观察 Figure 1 Observation of pollen germination and growth of pollen tubes under microscope A：授粉后0.5 h，2×襈，正常二倍体花粉；B授粉后2.0 h，4×襈，四倍体正常花粉；C：授粉后2.0 h，4×襈，四倍体花粉；D：授粉后2.0 h，2×襈，二倍体花粉管从柱头细胞间长出引导组织；E：授粉后3.0 h，4×襈，四倍体花粉管扭曲；F：授粉后5.0 h，4×襈，四倍体花粉管扭曲；G：授粉后3.0 h，4×襈，四倍体双萌发孔双花粉管；H：授粉后5.0 h，4×襈，四倍体双萌发孔双花粉管；I：授粉后5.0 h，4×襈，四倍体花粉管中间分叉；J：授粉后8.0 h，2×襈，花粉管在花柱内生长；K：授粉后8 .0 h，4×襈，花粉管在花柱内生长；L：授粉后8.0 h，2×襈，花粉管进入子房 |
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表 1 同源四倍体及其原二倍体黑皮冬瓜自交花粉在柱头上的萌发率比较1) Table 1 Comparison of pollen germination rate on pistils of autotetraploid and diploid black wax gourd |
由图1及表2可知，二倍体与四倍体花粉管的形态及生长情况存在明显差异。二倍体自交的花粉管生长速度较四倍体快，且花粉管粗细均匀一致，在花柱中能形成明显的花粉管“束”或“流”(图1D、1J)。而四倍体自交的花粉管生长较慢，花粉管“束”或“流”状不明显(图1K)，且在生长过程中出现较多的异常现象，如：出现花粉管在生长过程中扭曲、缠绕(图1E、1F)，或单个花粉粒同时萌发双花粉管(图1G、1H)，或出现单花粉管在生长中途分叉形成双花粉管情况(图1I)。由于冬瓜柱头较大，取材料时是从柱头和子房连接处切断摘取，当花粉管生长接近材料底端或者在靠近材料底端时出现生长断节现象即可认为花粉管生长进入子房。由表2可知，随自交授粉时间的后延，二、四倍体的花粉管伸长生长速度都呈现逐渐增加趋势。二倍体自交花粉萌发最早，其花粉管的生长速度在各个时间段均明显较四倍体的快，在授粉后8.0 h即进入子房(图1L)，而四倍体自交花粉的萌发较慢，其花粉管的伸长生长速度也较慢，在授粉后12.0 h还未进入子房。
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表 2 同源四倍体及其原二倍体自交花粉管在雌蕊中的生长速度比较1) Table 2 Comparison of growth rates of pollen tubes in pistils of autotetraploid and diploid black wax gourd |
由表3可知，各內源激素标准曲线相关系数均在0.96以上，符合各內源激素酶联免疫试剂盒要求的相关系数在0.95以上的要求，说明线性方程耦合性较好，可用于各內源激素浓度分析计算。
由表4、5可知，同源四倍体及其原二倍体黑皮冬瓜花粉和雌蕊中內源激素含量保持相同趋势，均以ABA含量为最高，依次为ZR、GA3、IPA，以IAA含量为最低，且同源四倍体及其原二倍体黑皮冬瓜的花粉中各內源激素的含量均普遍略高于雌蕊。具体表现为：四倍体花粉与雌蕊中ABA含量均显著高于二倍体；ZR和IPA含量均极显著低于二倍体；IAA含量均略低于二倍体，但差异不显著；花粉中GA3含量不同倍性材料差异不显著，但雌蕊中GA3含量四倍体显著低于二倍体，同时四倍体花粉及雌蕊中的GA3+IAA+ZR+IPA含量及w(GA3+IAA+ZR+IPA)∶w(ABA)均极显著低于二倍体。
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表 3 內源激素标准曲线 Table 3 The standard curves of endogenous hormones |
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表 4 同源四倍体及其原二倍体黑皮冬瓜花粉內源激素含量比较1) Table 4 Comparison of endogenous hormone contents in pollens of autotetraploid and diploid black wax gourd |
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表 5 同源四倍体及其原二倍体黑皮冬瓜雌蕊內源激素含量比较1) Table 5 Comparison of endogenous hormone contents in pistils of autotetraploid and diploid black wax gourd |
Sawhney等[31]认为植物育性直接或间接地受到其内源激素的影响。周志翔[32]研究指出，花粉的发育、萌发、花粉管的伸长生长和授粉受精过程均受內源激素调控。Ma等[26]研究表明，GA3、IAA及ABA等內源激素在花粉萌发、花粉管伸长及受精过程中发挥重要作用。王玖瑞等[33]的研究表明，花粉萌发率与內源激素含量存在相关性，冬枣花粉萌发率较低的原因可能是由于花粉中较低的赤霉素(GA3)和细胞分裂素(玉米素Z)所致。谭素英等[29]研究则表明，同源四倍体西瓜自交花粉萌发率低及花粉管生长缓慢与花粉本身ZR含量过高有关。
由本试验结果可知，同源四倍体及其原二倍体黑皮冬瓜花粉中内源激素含量和花粉的育性存在明显的差异，说明花粉的育性受本身的內源激素的调控。四倍体黑皮冬瓜花粉萌发率及花粉管生长速度明显低于二倍体，主要是由于四倍体黑皮冬瓜花粉中的细胞分裂类激素(ZR和IPA)含量极显著低于二倍体，不利于花粉母细胞四分体形成；同时其他促进生长类激素(IAA和GA3)含量略低于二倍体，干扰了花粉小孢子的正常发育或者影响花粉母细胞的膨大，最终导致了花粉萌发率低；而抑制生长类激素ABA含量显著高于二倍体，促进四倍体形成退化的花粉(如：扁形、三角形、空瘪、凹陷或粘连花粉等)，导致四倍体黑皮冬瓜的花粉萌发率低，花粉育性降低，花粉管生长缓慢，进而影响四倍体的育性。这与谭素英等[29]在同源四倍体西瓜花粉育性低的结果不一致，可能是试验材料不同所引起的。
3.2 花粉在柱头上的识别及花粉管的生长受雌蕊内源激素的调控贺丹等[34]在牡丹和芍药、杨晓苓等[24]在百合上的研究表明，雌蕊中高水平的IAA、GA3、ZR有利于花粉与柱头的识别黏附、萌发，促进授粉受精的正常进行，高水平的ABA可能与不亲和授粉相关；梨花柱中高水平的IAA、GA3、ZR利于授粉受精正常进行，低水平的IAA、GA3、ZR可能使自交授粉亲和性下降[22]；张鹏等[27]研究表明，雌蕊柱头中高浓度的IAA、GA3、ZR参与了花粉和柱头的应答，并促进了花粉在柱头的萌发与生长，而高水平的ABA可能是抑制花粉萌发及伸长的原因之一。综合前人的研究表明：雌蕊中高水平的促进生长类激素(IAA、GA3、ZR、IPA等)可有效促进花粉在柱头的识别、萌发和花粉管在花柱中的伸长生长，而高水平的ABA则对花粉的萌发与花粉管的生长起抑制作用，会诱导自交亲和力降低。
本试验结果表明，二倍体黑皮冬瓜自交授粉后，花粉在柱头的萌发率高、花粉管在雌蕊上生长速度明显快于四倍体，在授粉8.0 h后花粉管伸入子房，而四倍体自交花粉萌发率低、花粉管生长缓慢，授粉后12.0 h仍未进入子房。通过分析雌蕊中内源激素含量可知，这是由于二倍体雌蕊上的促进生长激素GA3、ZR和IPA的含量相比四倍体处于较高的水平，ABA含量相比于四倍体处于较低水平引起的。这说明二倍体雌蕊中的GA3、ZR和IPA参与了花粉与柱头及花柱的应答，促进了花粉的萌发与伸长。而四倍体雌蕊中低水平的GA3、ZR和IPA含量及高水平的ABA含量，在一定程度上抑制了花粉在柱头的识别、萌发及花粉管的伸长，诱导了自交亲和力降低，使得育性下降。
3.3 花粉的萌发及花粉管的生长与促进生长类激素/抑制生长类激素比值相关各类植物內源激素在植物组织中普遍存在，每种激素都在其特定的浓度范围内调控植物的生长发育，各种激素在植物体内都不是独立存在的，它们在植物的生长发育过程中可通过互相协调或拮抗来发挥激素的作用，因此植物的授粉受精和果实发育不仅受到单个內源激素的影响，主要还是与促进生长类激素和抑制生长类激素的平衡性相关[29, 35]。谭素英等[29]的研究表明，同源四倍体西瓜花粉的萌发与花粉管的生长与花粉及雌蕊中(IAA+GA3)/ABA比值有关，四倍体西瓜花粉与雌蕊中(IAA+GA3)/ABA比值显著低于二倍体，不利于花粉的萌发与伸长。姚志敏[23]研究发现，自交、异交亲和性较高烟草品种K326自交、异交后，其雌蕊柱头(IAA+GA+Z+IPA)/ABA比值较高，而自交亲和性较差的烟草品种N.alata自交后，其雌蕊柱头(IAA+GA+Z+IPA)/ABA比值一直处于较低水平，使得花粉萌发与生长受到抑制。张鹏等[27]和齐国辉等[22]的研究也均表明，亲和力较低的授粉材料雌蕊中的(IAA+GA+Z+IPA)/ABA比值均远低于亲和授粉材料。贺丹等[34]在牡丹和芍药中的研究也指出，雌蕊中的(IAA+GA3)/ABA比值与亲和性相关，高水平的(IAA+GA3)/ABA比值利于花粉的萌发与生长。
本试验中，通过比较花粉及雌蕊中(IAA+GA3+ZR+IPA)/ABA的比值可知，二倍体黑皮冬瓜花粉与雌蕊中(IAA+GA3+ZR+IPA)/ABA的比值均显著高于四倍体，使得用于生长的激素总量多，促进生长类激素消除抑制生长类激素作用外，还有一部分结余能用来促进花粉的萌发与生长，因此二倍体黑皮冬瓜的花粉萌发率及花粉管的生长速度明显高于四倍体；而四倍体黑皮冬瓜花粉及雌蕊中本身的促进生长类激素就不够，抵消掉抑制生长类激素的作用后，余下用于促进生长的效应就很小，对花粉的萌发和花粉管的生长作用就较微弱，导致四倍体黑皮冬瓜花粉的萌发率低、生长缓慢[28]。
另外，在田间实践中发现♀4×和♂2×杂交能很容易座果并获得有活力的种子，平均单瓜产籽数(约200 粒)居于2×襈和4×襈产生的种子数之间，这是否表明花粉与雌蕊中的内源激素存在一定的互作，只要花粉和雌蕊间激素互补达到一定水平就能促进花粉的正常萌发生长呢？这还需要进一步试验论证。
综合分析认为，同源四倍体黑皮冬瓜自交花粉在柱头上的萌发率低，花粉管在花柱中生长缓慢，且花粉萌发和生长过程中易出现花粉管粗细不均匀、结节状、先端膨大、双花粉管及扭曲、折叠等现象，这是引起四倍体黑皮冬瓜自交低稔性的原因之一。通过对花粉及雌蕊中内源激素含量测定结果表明，引起同源四倍体黑皮冬瓜花粉萌发生长出现异常的原因与四倍体黑皮冬瓜花粉和雌蕊中内源激素ZR和IPA含量过低，ABA含量过高及(IAA+GA3+ZR+IPA)/ABA比值过低有关。花粉和雌蕊中的内源激素调控了花粉的萌发生长，进而引起其自交低稔性。
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