突变体是功能基因组学研究的重要材料，也是作物育种的基础^[1]。新的突变体可直接或间接地在生产上利用，加快作物育种进程^[2-3]。重离子诱变作为一种新兴的辐射诱变手段，具有变异率高、变异谱宽、变异稳定快、诱变方法稳定可靠和简单易行等独特优势，能够诱发植物基因组在当代发生可遗传变异，近年来为作物改良提供了新途径^[4-5]。目前，重离子诱变已广泛用于创建新种质，尤其是用于高等植物辐射诱变育种，在植物育种中发挥着重要作用^[6-10]。水稻Oryza sativa L.作为最主要的粮食作物之一，为全世界一半以上的人口提供主食^[11]。利用重离子诱变技术诱导突变体，构建水稻突变体库，创造丰富的水稻种质资源，不仅可以为水稻功能基因组学提供有价值的研究材料，同时也是选育优良水稻品种的有效手段，目前已培育出优质、高产、在生产上大面积推广的水稻新品种^[12-13]。本研究以水稻品种‘IR-55’、‘IR-60’和‘三粒寸’等为试验材料，利用碳离子辐射诱变技术，诱变后连续多代种植并跟踪调查筛选，以期获得一系列突变株系，丰富水稻的突变体资源库，为后续重离子辐照诱变机理研究以及水稻育种提供有利的基础材料。

1 材料与方法 1.1 材料

供试材料为‘IR-55’、‘IR-60’、‘三粒寸’和‘云南陆稻’共4个水稻品种原种及其重离子辐照诱变后代。

1.2 试验设计

水稻干种子(M₀)(每个品种300粒)经中国科学院近代物理研究所重离子加速器国家实验室提供的80 MeV·u^{–1 12}C⁶⁺离子束辐照诱变处理(辐射剂量为100 Gy)后，田间种植。M₁代单株主穗混收，双垄种植，筛选不同类型突变株，M₂单株成系种植，常规栽培管理，开展田间调查和室内考种考察各突变株系的主要农艺性状。

1.3 突变株系遗传多样性检测方法 1.3.1 突变株系与原种株系DNA提取

采用简易法快速提取叶片DNA，叶片用液氮研碎，加800 μLTPS；75 ℃水浴0.5~3.0 h(每10 min摇1次)，11 000 r·min^–1离心10 min；取上清液转移至2 mL离心管，加入等体积预冷的冷冻异丙醇/无水乙醇(摇匀后，置–20 ℃充分沉淀DNA)，11 000 r·min^–1离心10 min；弃上清液，取沉淀，加200 μL φ为70%的乙醇溶液，3 500 r·min^–1离心5 min；弃上清液，将沉淀干燥，加200 μL 1×TE(含4~5 μL RNA酶)溶解，4 ℃保存备用。调查统计突变株系数量，计算多态性频率：

多态性频率=存在多态性的突变株系数量/总突变株系数量×100%。

1.3.2 SSR标记分析

PCR扩增采用20 μL反应体系：2× PCR Reaction Mix 10 μL(含100 mmol·L^–1 KCl、20 mmol·L^–1 Tris-HCl、3 mmol·L^–1 MgCl₂、400 mmol·L^–1 dNTP)，Taq酶(5 U·μL^–1)0.2 μL，引物(10 μmol·L^–1)各1 μL，模板DNA 1 μL，超纯水补至20 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30~60 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物4 ℃保存备用。扩增产物用80 g·L^–1变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，w为0.1%的硝酸银溶液染色10 min，显影液摇动显影10 min后用自来水清洗，检验扩增条带，观察电泳结果。

2 结果与分析 2.1 重离子辐照诱变后代突变株系主要农艺、经济性状变异

每个诱变品种M₀代种植后，成活率均在95%以上。M₁代单株主穗混收后，每个品种分别种植1 000株，进行突变体筛选，‘IR-55’、‘IR-60’、‘三粒寸’和‘云南陆稻’4个品种分别得到48、31、15和47株突变株系。在M₂代对各候选突变株系继续进行小区种植，并对株高、剑叶长、剑叶宽、穗长、结实率、十粒长、十粒宽和长宽比等主要农艺性状进行调查和统计。总体而言，4个水稻品种突变株系株高、剑叶长、穗长和粒长宽比等性状呈现出较大变异，发生明显的正向或负向变异(图1)。结实率在各品种突变株系中均呈现明显下降趋势，表明辐照诱变对突变后代结实率有较强的负向效应。‘IR-55’突变株系结实率低至2%，‘三粒寸’的突变株系结实率比其他品种的下降趋势更为明显。剑叶宽也呈相似的下降趋势，但下降幅度比结实率小。就单个性状而言，不同品种由于遗传背景的差异，辐照诱变效应也存在一定差别。‘三粒寸’突变株系的粒型性状如十粒长和十粒宽比其他品种变异幅度大，‘IR55’和‘云南陆稻’粒型性状变异幅度不明显。

2.2 重离子辐照诱变后代突变株系遗传多样性初步分析

为了进一步分析表型发生明显变异的突变株系在DNA水平的差异水平，探讨重离子辐照诱变机制，我们利用随机选取的120对SSR分子标记引物(每条染色体10对)对所有品种的原种和突变体株系进行初步遗传分析发现，共有28对引物在原种和突变株系间检测出多态性。对每个品种不同染色体检测出多态性的频率进行统计，结果表明，辐照诱变后不同染色体检测出的多态性频率存在一定差异。所有品种的10号染色体均没有检测出多态性，11号染色体检测出的多态性频率最高，为6.7%。原种和突变株系间遗传多态性差异水平因品种而异，‘IR55’平均遗传多态性变异频率最低，为1.4%，‘三粒寸’平均遗传多态性变异频率最高，达3.9%。

2.3 部分稳定的突变体性状变异

重离子辐照诱变群体经全生育期、多造别、多世代(M₁、M₂)的田间筛选，鉴定出多个性状发生突变的株系。这些突变株系的生育期、株/叶型和籽粒等性状呈现出丰富变异，为重离子辐照诱变机理研究和水稻育种提供了丰富的基础材料。

2.3.1 生育期突变体

重离子辐照诱变后，4个水稻品种出现多个生育期突变株系，开花提前或延迟。突变株系的抽穗期较原种出现较大差异，表现出早熟或晚熟性状(图2)。

2.3.2 株高突变体

株高的变异是突变株系较为明显的特征。‘IR55’和‘三粒寸’2个品种的突变株系中，均出现植株明显矮化，但株型和抽穗期无明显变化的突变株系(图2)。田间观察发现有些突变株系多个性状(如株高和抽穗期)同时发生改变，如‘IR60’出现株高增高、抽穗期也明显提前的突变株系(图2)。

2.3.3 粒型突变体

粒型的丰富变异也是重离子辐照诱变效应的突出特点，4个品种突变株系的粒型呈现丰富的变异。‘IR55’、‘云南陆稻’、‘三粒寸’和‘IR60’4个品种均出现籽粒增大和变小2种突变类型(图3)。

3 讨论与结论

重离子辐射能诱发基因组在当代发生可遗传变异，并具有高突变率的优势，对创造新型种质、提高育种效率和加快育种进程具有重要意义^[14-15]。前人在小麦^[9]、大豆^{[14, 16]}、玉米^[17-19]和大葱^{[6, 20-21]}等作物离子辐照诱变后代农艺性状变异研究中发现，同一作物的不同品种和不同性状对辐照的敏感性不同，离子束对作物性状的诱变既有正向诱变效应也有负向诱变效应。因此在辐照后代的选择中可以保留正向符合育种要求的突变而淘汰表现较差的突变类型，宽的突变谱更利于培育出符合育种目标的新品种材料。本研究也发现，4个水稻品种突变株系在株高、剑叶长、穗长和粒长宽比等性状上呈现出较大变异幅度，有明显的正向或负向性。大豆辐照诱变后单株荚数和单株粒数与对照相比平均提高了4.28%和3.72%^[14]，而本研究中水稻的结实率则整体出现明显的下降趋势，表明不同作物的结实性状对辐照的敏感性存在差异。离子束辐照主要引起生物体的原初损伤和遗传物质的变异^[22]，遗传物质的变异主要是DNA分子序列较大的改变，不会是点突变^[23]。本研究利用随机选取的分子标记引物对突变体进行遗传多样性的检测结果也表明，经过重离子辐照后，水稻突变体中部分DNA序列发生较大片段的改变，与原种相比表现出一定差异。

遗传资源的单一和匮乏是作物育种实践的瓶颈，多途径拓宽植物的种质资源对育种实践具有重要意义。本研究利用重离子辐照诱变筛选获得了一批水稻突变体，为水稻遗传育种研究提供了丰富的材料基础。随着作物分子育种向高效精准方向发展，作物突变体的表型鉴定需要更高的精度^[24]，高通量测序鉴定技术是未来突变体筛选的发展趋势。