湖北光敏核不育水稻Oryza sativa L.‘农垦58S’^[1-2]的发现为水稻杂种优势利用带来新的革命。袁隆平^[3]于1987年提出杂交水稻的战略和规划后，以光温敏核不育水稻(以下简称“两系不育系”)为基础的两系法杂交水稻研究方兴未艾，基础理论及其在育种上的应用研究取得瞩目的进展，各种类型的两系不育系层出不穷。迄今，我国累计通过审定的两系组合730个，由农业部冠名的超级稻示范推广品种达130个(农办科〔2017〕11号文)，两系杂交水稻占32个。截止2017年9月，全国已鉴定(含审定)的两系不育系431个，有组合通过审定的为330个，其中审定组合数20个以上的不育系有11个，分别是‘Y58S’(109个)、‘培矮64S’(70个)、‘株1S’(60个)、‘C815S’(35个)、‘广占63-4S’(34个)、‘隆科638S’(31个)、‘深08S’(27个)、‘湘陵628S’(26个)、‘HD9802S’(23个)及‘广占63S’(21个)。‘培矮64S’配组的杂交稻有70个通过审定(7个通过国家级农作物品种审定，4个被农业部冠名为超级稻)，其中华南地区37个，超过总数的一半，广东地区26个(3个国审)。实践证明，‘培矮64S’对两系杂交水稻甚至整个杂交稻的贡献卓越。‘培杂双七’连续5年为广东省年种植面积最大的杂交稻组合，‘两优培九’更是被誉为超级杂交稻的先锋组合^[4]。‘培杂泰丰’、‘培两优288’等超级稻组合曾以压倒性的丰产稳产优势在生产上大面积推广种植，受到各级农业部门和农民的青睐，极大地推动了两系杂交水稻的发展。然而，在大量新的两系不育系如‘Y58S’、‘C815S’等涌现之后，‘培矮64S’已逐步退出历史舞台，自2011年起，该不育系几乎没有组合通过审定。其中的一个主要原因是不育起点温度的遗传漂移，目前生产上的‘培矮64S’不育起点温度较之前鉴定的23.3 ℃已上升了不少，有的已超过24.2 ℃^[5-6]，严重影响了杂交种子生产的安全性。另外，与稻米品质直接相关的直链淀粉含量(Amylose content，AC)也是一个不容忽视的原因。笔者测定了目前生产上正在使用的‘培矮64S’的AC，平均值（w）为25.5%。调查发现，与‘培矮64S’配组审定的70个杂交稻中，AC最低的为14.8%(‘培两优288’，国审品种)，最高为28.9%(‘培杂航香’)，平均为25.5%，与母本相当，达不到国家优质稻米的标准。

实践证明，空间诱变育种在改良稻米的直链淀粉含量方面效果明显，经空间诱变的群体，存在不同直链淀粉含量的突变体^[7-11]。本研究利用‘培矮64S’经“实践八号”农业卫星搭载、地面种植和跟踪、定向筛选，选育具有低直链淀粉含量(质量分数为9%左右)的稳定不育株系，同时结合袁隆平^[12]提出的水稻光温敏不育系的提纯和原种生产方法，对不育起点温度进行加压选择，以期育成低直链淀粉含量、低不育起点温度的新型“双低”不育系，解决水稻两系不育系‘培矮64S’所面临的直链淀粉含量偏高和不育起点温度因遗传漂移而不断上升的问题。

1 材料与方法 1.1 材料

水稻两系不育系‘培矮64S’及其经空间诱变后的株系。

1.2 方法 1.2.1 空间诱变及种植方法

空间诱变是将‘培矮64S’干种子(保留一部分作为对照)搭载“实践八号”农业卫星(2006年9月9日发射，在轨运行15 d，卫星运行的近地点高度180 km、远地点高度469 km，轨道倾角63°)^[13]后返回地面。2007年在华南农业大学实验基地种植搭载种子SP₀代和对照种子，晚秋割茬再生，利用自然低温复育，混收得到SP₁代及对照种子。同样的方法，扩繁至SP₃代。

1.2.2 突变体的筛选及直链淀粉含量测定

利用Wx基因连锁标记RM190(484/485)对诱变后代株系进行初步筛选，DNA的提取参考赵国珍等^[14]的方法，PCR扩增及电泳凝胶检测参考张建勇等^[15]的方法。利用国家植物航天育种工程技术研究中心开发的基于HRM(高分辨率溶解曲线)的Wx基因的功能标记Wx-a/b^[16]、参照罗文龙等^[17]的方法对初筛诱变株系进行鉴定。直链淀粉含量测定参照优质稻谷GB/T17891—1999^[18]的品质分析方法。

1.2.3 突变单株(系)不育起点温度的加压选择

不育起点温度的加压选择分3步进行。第1步是淘汰，在水稻幼穗分化花粉母细胞减数分裂的第Ⅲ期末，将待处理植株移蔸至大型恒温水槽(DCW–1500)中，从第Ⅳ期开始进行冷处理10 d(23.5 ℃恒温、自然光照、水深为漫过植株生长点3~5 cm)，对处理到位的穗子进行标记。对标记好的穗子在抽穗开花后连续进行花粉镜检(用10 g·L^–1 I-KI溶液染色)，套袋检查自交结实率。淘汰败育不彻底(花粉部分或全部可育，套袋有结实)的单株，剩余单株均送海南省三亚市进行加代扩繁成株系。第2步是初步筛选，对加代后的株系，扩大群体种植，按照上述方法设置低温处理(温度设为23.0 ℃)，每个株系处理50株以上单株，最终筛选败育彻底较多的单株(系)。第3步对新入选单株的繁殖后代群体进行23.0 ℃的加压选择与验证，严格筛选出败育彻底的株系。

1.2.4 不育起点温度测定

不育起点温度的鉴定参照农业部颁发的“水稻光、温敏雄性核不育系育性鉴定规程”(NY/T1215—2006)^[19]进行。

2 结果与分析 2.1 突变体植株的获得

利用SSR标记RM190(484/485)对SP₂代群体的5 500个单株进行了多态性筛选，发现单株T0122、T0172和T4503在RM190扩增位点上表现出多态性。单株再经低温处理后，仅T0122和T0172收到少量SP₃代种子。全部种植SP₃代，去除个别杂株后得到60个单株，单株成系种植，至2012年晚造，有36个SP₆代株系得以保留。继续用标记RM190(484/485)对36个株系的幼苗进行多态性扩增，发现有11个株系表现出(CT)n的多态性(图1A)。

考虑到(CT)n具有多种多态性且不同的(CT)n与直链淀粉含量的高低相关^[20-21]，进一步利用HRM-SNP标记Wx-a/b对上述株系进行基因分型，结果如图1B所示。根据RM190和Wx-a/b标记共同的分析结果，确定为低直链淀粉含量的株系有9个。

2.2 突变体株系杂种优势分析

根据2012年晚造基因分型的结果，对具有Wx^b型的9个株系分别与‘航恢1173’、‘航恢1179’、‘航恢168’、‘航恢508’、‘航恢190’、‘泰丰占’、‘航恢7号’、‘1H1124’、‘BBS-15’和‘R261’等20个测交系测交，2013年晚造种植9个株系及180个测交组合，按照株系和测交组合田间综合表现(目测)，入选4个株系(南繁编号：HM-12、HM-15、HM-17、HM-21)。入选株系经低温处理再生结实，冬季送海南扩繁。

2.3 突变体株系不育起点温度的加压选择

2012年晚造对9个Wx^b型株系进行不育起点温度初步筛选(23.5 ℃恒温)，结果(表1)表明，不同株系的转育情况有一定差异。23.5 ℃处理10 d，仍然表现败育彻底的株系有HM-15和HM-17，其他株系及对照均有不同程度的复育且有部分单株自交结实。经过对比株系内和株系间的单株育性，发现单株之间的育性差异较大，说明可能在不育起点温度上存在微分离。为此，我们对株系HM-17进行扩繁后，按照袁隆平^[12]提出的水稻光温敏不育系的提纯和原种生产方法，连续进行4轮加压选择，最终在HM-17后代群体中发现1个单株(2014年编号M-155-2-2)的不育起点温度在23.0℃以下，育性稳定、败育彻底。该突变体自交后代群体整齐，育性稳定，正式命名为‘航17S’。

2.4 突变体株系直链淀粉含量测定

2014年4月从海南分别收取4个株系及对照株系的单株及混收种子进行直链淀粉含量测定，结果见表2。由表2可见，4个株系中，直链淀粉质量分数最低的是HM-17(平均值为8.69%)和HM-21(平均值为9.07%)，对照‘培矮64S’的直链淀粉质量分数为25.55%。这也进一步证明了基于Wx基因开发的HRM功能标记Wx-a/b在鉴定高/低直链淀粉含量上的准确性。

2.5 突变体株系‘航17S’与野生型‘培矮64S’的主要农艺性状比较

由图2和表3可见，突变体株系‘航17S’与野生型‘培矮64S’的株叶形态及其他主要农艺性状基本相似；除剑叶宽外，其他主要农艺性状均无显著差异。主茎叶片数均为11~13片，出叶速率和分蘖增长率表现一致。开花习性方面，‘航17S’的柱头外露率为82%，比‘培矮64S’高出8.7%；‘航17S’的午前花率为71.8%，高于‘培矮64S’(65.8%)。

3 讨论与结论

直链淀粉含量(AC)是稻米食用品质最重要的影响因素，与蒸煮品质和食味品质密切相关。AC与米饭黏性、柔软性和光泽等食味品质呈负相关，所以AC越高的米饭越硬、口感越差^[22]。Wx基因编码的颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)是直链淀粉合成的关键酶^[23]，具有一系列复等位基因^[24-25]，从而影响直链淀粉含量，是目前生产上利用的最主要的基因资源。直链淀粉质量分数在5%~15%之间的低直链淀粉水稻，是介于普通稻米和糯米之间的中间类型，是改良稻米直链淀粉含量和食味品质的理想材料。目前已经报道了20多种低直链淀粉突变体，其直链淀粉质量分数均低于15%，胚乳外观表型多为半透明或不透明，少数为透明^[26]。在育种实践上，由于直链淀粉性状属于三倍体遗传，利用Wx复等位基因改良水稻AC难度较大。高AC与低AC的杂交后代中能出现中等AC的个体，但这种个体的基因型是杂合的，后代还会出现分离^[19]，最终产生与亲本AC相似的纯合体，这种育种方式周期长、效果差。如果利用非Wx低直链淀粉基因资源，由于遗传重组的存在，在杂交后代中可以较快得到中等AC的纯合体。实践证明，空间诱变育种在改良稻米AC方面效果显著，经空间诱变的群体，存在不同AC的突变体^[7-11]。本研究通过空间诱变与定向筛选育成的‘航17S’直链淀粉质量分数低于10%，更有利于选育出AC中等偏下的杂交稻组合。

此外，两系不育系的不育起点温度直接关系到两系杂交水稻生产的安全性问题。具有较低不育起点温度的不育系制种安全，保证了杂交水稻种子的纯度和质量。‘培矮64S’是以‘农垦58S’为母本、广亲和系‘培矮64’为父本，通过杂交选育而成的光温敏核不育系^[27]。然而，‘培矮64S’在生产过程中由于不育起点温度漂移而被淘汰。分析认为，在不施加任何选择压力的情况下，光温敏不育系同一株系不同世代的群体，不育起点温度有逐代升高的趋势^[5]。于永红等^[28]通过对不同来源的5份‘培矮64S’的研究发现，‘培矮64S’的育性转换光温反应特性表现出明显的地区间和年度间差异。引起这一现象的根本原因是不育系本质上是由光温反应存在差异的杂合个体组成的混合群体，遗传分离、环境影响以及人为选择导致了临界温度的变化^[29]。这种差异以及所造成的分离表现为某些个体不育起点温度上升，某些个体不育起点温度下降，本研究就是利用不育起点温度下降的特点成功地从‘培矮64S’空间诱变的低AC的突变体株系中通过多次加压选育出低不育起点温度的新材料。这也进一步证实，该方法是降低两系不育水稻不育起点温度的有效途径之一^[30]。