果蔗Saccharum officinarum L.是热带亚热带地区最重要的经济作物之一^[1]。我国种植果蔗历史悠久，种植范围广，主要产区为广东、广西、海南和福建等省区。近几年来，随着南凉北热的逆差、品种引进驯化和栽培技术的改进等，果蔗蔗区逐年北移，现已扩大至河北、河南、山东等省^[2]。果蔗各品种间的耐寒性差异较大，有些耐寒性较差的品种无法适应北方的气候条件，温度特别是早春低温是果蔗引种和生产的重要限制因素之一，因此，研究果蔗的抗寒性，选育抗寒品种已成为果蔗南种北引亟待解决的关键问题。在各种环境胁迫中，低温对植物的影响尤为突出，植物在低温胁迫下，膜脂过氧化产物丙二醛含量升高，细胞膜透性增大^[3]，可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸等渗透调节物质积累，保护酶活性升高^[4]。在植物抗寒性研究和评价中，上述指标常被用作指示植物抗寒性的指标，隶属函数法是目前普遍采用的抗性综合评价方法^[5]。

在甘蔗耐寒性研究方面，前人对糖蔗的耐寒性研究较多。丘立杭^[6]研究表明，不同甘蔗品种受低温胁迫后，叶片可溶性糖含量均上升，耐寒性强的品种可溶性糖含量最高且增幅最大。黄杏等^[7]研究表明，甘蔗受到低温胁迫后叶片脯氨酸含量上升，不同冷敏感型品种间存在较大差异。孙波等^[8]和李素丽等^[9]研究发现，甘蔗在受到持续低温胁迫后，不同耐寒性的品种根系中可溶性糖含量均呈现上升趋势，但品种之间可溶性糖含量存在差异。有关果蔗耐寒性研究鲜有系统的研究报道。本研究选取在广西、福建、四川生长良好、种植面积较广的6个果蔗品种作为试验材料，采用人工模拟低温环境的方法，对果蔗幼苗进行低温胁迫，测定幼苗抗寒性相关的生理生化指标，研究不同果蔗品种对低温胁迫的生理响应，并对其抗寒性进行综合评价，筛选出抗寒性强的品种，为果蔗抗寒育种、引种及栽培区划分提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

试验于2016年4月在平顶山学院低山丘陵区生态修复重点实验室进行。供试的果蔗品种为‘桂果蔗1号’、‘拔地拉’、‘闽引黄皮果蔗’、‘龙黑果蔗’、‘白玉果蔗’和‘川蔗26号’。其中，‘桂果蔗1号’和‘拔地拉’由广西农业科学院甘蔗研究所提供，‘闽引黄皮果蔗’、‘白玉果蔗’和‘龙黑果蔗’由福建省农业科学院甘蔗研究所提供，‘川蔗26号’由四川省植物工程研究院提供。

1.2 方法 1.2.1 试验设计

将6个果蔗品种单芽种茎温汤脱毒处理后放进沙盘中沙培，待果蔗长出2~3片叶时，将蔗苗从沙中移出，选取长势一致的果蔗苗移栽至25 cm×30 cm的营养桶中土培，每桶种植2株，按日常管理生长50 d，果蔗约为5~6叶期时，分组进行处理，每个品种为1个处理，重复3次。将果蔗幼苗置于低温培养室内(温度0 ℃)，光照度为300~400 μmol·m^–2·s^–1，12 h光︰12 h暗，相对湿度65%~75%，连续胁迫14 d，处理期间土壤含水量(w)保持25%左右。分别于低温处理后0、7、14 d取各处理幼苗+1叶(甘蔗最高可见肥厚带叶片)，分别进行各种生理指标的测定，所有指标均设置3个重复。

1.2.2 生理指标测定方法

相对电导率(Relative conductivity, REC)以及丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、可溶性糖(Soluble sugar, SS)、可溶性蛋白 (Soluble protein, SP)和脯氨酸(Proline, Pro)含量测定参照张以顺等^[10]的方法；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(Peroxidase, POD)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase, APX)活性的测定参照Parida等^[11]的方法。在25 ℃条件下，每分钟内转化1 μmol底物所需的酶量定为一个酶活力单位(U)。

1.2.3 果蔗品种耐寒性综合评价方法

本研究中的抗寒系数为低温胁迫处理14 d时的测定值与常温处理的测定值的百分比，即

${\text{抗寒系数}}=\frac{{\text{低温胁迫后指标测定值}}}{{\text{对照指标测定值}}} \times 100{\text{%}}{\text{。}}$

采用模糊综合评判方法中的隶属度公式，对试验原始数据进行定量转换，以综合评价不同果蔗品种的耐寒性。参照何雪银等^[12]的方法，计算隶属函数值和平均隶属度，分析评价不同果蔗品种的抗寒性。其中，与抗寒性呈正相关的指标用公式(1)计算，与抗寒性呈负相关的指标用公式(2)计算；隶属函数法评定时，隶属函数平均值越大，则耐寒性越强。

$\text{隶属函数} = \left( {{X_i}-{X_{\min }}} \right)/\left( {{X_{\max }}-{X_{\min }}} \right),$

(1)

$\text{反隶属函数} = 1-\left( {{X_i}-{X_{\min }}} \right)/\left( {{X_{\max }}-{X_{\min }}} \right),$

(2)

式中，X_i为指标测定值，X_min和X_max分别为所有参试材料某一指标的最小值和最大值。

1.2.4 数据统计与分析

采用SPSS19.0软件进行数据相关性分析和主成分分析，采用LSD法进行显著性分析，用Excel 2007进行数据计算和制表。

2 结果与分析 2.1 低温胁迫对果蔗叶片REC、MDA和渗透调节物质含量的影响

由表1可以看出，不同果蔗品种幼苗叶片经7和14 d低温胁迫后与对照(0 d)相比，叶片REC以及SS、SP和Pro含量均上升，但上升幅度不同，经7 d低温胁迫后的指标均高于常温处理(0 d)，差异达显著水平(P<0.05)；除MDA含量外，经14 d低温处理后的指标也均高于7 d低温处理，差异达显著水平(P<0.05)。而MDA含量在处理7 d时，达最大值，与对照的差异达显著水平(P<0.05)；处理14 d时，反而有所下降，但仍高于常温处理(0 d)。

2.2 低温胁迫对果蔗叶片保护酶活性的影响

如表2所示，随着低温胁迫时间的延长，各供试材料的SOD、POD、CAT和APX活性均表现出先上升后下降的趋势，但变化幅度不同。在低温胁迫7 d时均达峰值，与常温处理(0 d)差异达显著水平(P<0.05)；随着低温胁迫时间的进一步延长，14 d时的酶活性均呈下降趋势。各供试材料的SOD活性的下降幅度最小，略低于低温胁迫7 d时的SOD活性，差异不显著，远高于常温处理(0 d)材料的SOD活性，差异达显著水平(P<0.05)。低温胁迫14 d时，各供试材料的POD、CAT和APX活性下降幅度均较大，远低于低温胁迫7 d时的酶活性，差异达显著水平(P<0.05)，但与常温处理(0 d)的酶活性差异不显著。

2.3 不同品种果蔗叶片各单项指标的抗寒系数

表3为6个品种果蔗各单项指标的抗寒系数，抗寒系数越大，表明该品种对低温的抵抗能力越弱。由表3可看出，经低温胁迫后，REC抗寒系数最大的是‘龙黑果蔗’(319.06%)，最小的是‘桂果蔗1号’(236.71%)；MDA含量抗寒系数最大的是‘川蔗26号’(142.15%)，最小的是‘桂果蔗1号’(103.84%)；SS含量抗寒系数最大的是‘桂果蔗1号’(329.38%)，最小的是‘川蔗26号’(239.40%)。除‘川蔗26号’、‘拔地拉’和‘龙黑果蔗’外，其余3个品种SS含量抗寒系数均在265%以上，说明‘桂果蔗1号’、‘闽引黄皮果蔗’和‘白玉果蔗’3个品种均具有一定的抗寒能力。SP含量抗寒系数最大的是‘桂果蔗1号’(280.05%)，最小的是‘龙黑果蔗’(201.43%)，说明‘桂果蔗1号’的抗寒能力最弱，‘龙黑果蔗’最强。Pro含量抗寒系数最大的是‘拔地拉’(225.79%)，最小的是‘白玉果蔗’(151.95%)，不同品种果蔗经低温胁迫处理后Pro含量提高幅度差异较大，说明不同品种通过增加体内Pro含量来提高其抗寒适应性的能力存在较大差异。SOD活性抗寒系数最大的是‘桂果蔗1号’(384.58%)，最小的是‘白玉果蔗’(236.72%)，除‘闽引黄皮果蔗’、‘白玉果蔗’外，其余品种SOD活性抗寒系数均在340%以上；POD活性抗寒系数最大的是‘桂果蔗1号’(113.26%)，最小的是‘川蔗26号’(89.04%)；CAT和APX活性抗寒系数最大的都是‘桂果蔗1号’(分别为126.62%和114.12%)，二者抗寒系数最小的均为‘闽引黄皮果蔗’(分别为103.08%和90.07%)。低温胁迫下，不同品种果蔗SOD、POD、CAT和APX活性出现不同程度的提高或降低，说明不同品种果蔗对低温的抵抗能力存在差异。

2.4 果蔗幼苗耐寒性指标的相关性分析

果蔗幼苗抗寒生理生化指标的相关性分析结果见表4。从表4可以看出，REC与SS含量呈极显著负相关(P<0.01)，与MDA含量呈显著正相关(P<0.05)，与SP含量、POD活性呈显著负相关(P<0.05)；MDA含量与POD活性呈极显著负相关(P<0.01)；SS含量与POD、CAT活性呈显著正相关(P<0.05)；SOD活性与CAT、APX活性分别呈显著正相关(P<0.05)和极显著正相关(P<0.01)。REC和MDA含量对果蔗抗寒性起负向作用，其值越高，抗寒性越低；SS、Pro含量以及SOD、POD、CAT和APX活性对果蔗抗寒性起正向作用，其值越高，果蔗抗寒性越强。可见，低温胁迫对果蔗的影响是多方面的，故在果蔗抗寒鉴定中，不能单独依赖上述某个或某2个指标对果蔗抗寒性进行评价。

2.5 果蔗幼苗各单项指标主成分分析

为了简化指标，分析指标之间的相互关系，对果蔗幼苗9个单项指标的抗寒系数进行主成分分析，将9个单项指标转化成9个相互独立的综合指标。主成分分析结果(表5)表明，第1主成分(A1)主要描述抗寒指标中的REC、MDA含量、SS含量、Pro含量、POD活性和CAT活性等，各指标具有绝对值较大的特征向量，贡献率达57.831%；第2主成分(A2)主要包括SP含量、SOD活性和APX活性，各指标具有绝对值较大的特征向量，贡献率达27.630%。第1、2主成分累积贡献率达85.460%。理论上，大于85%的累积贡献率即认为具有较强的信息代表性，这2个相互独立的综合指标基本上包括了9个生理指标所代表的全部信息，可用于果蔗品种的抗寒性分析。

2.6 利用隶属函数综合评价果蔗的耐寒性

为了能够比较全面地反映甘蔗的抗寒性，避免单一指标的局限性与片面性，采用模糊数学中隶属函数法，选用与果蔗抗寒性相关的生理指标对６个果蔗品种抗寒性进行综合评价，综合评价值越大，表明其耐寒能力越强。各果蔗品种的平均隶属度见表6。由表6可见，6个供试材料间的综合评价值差异较大，介于0.355~0.648 之间，表现为‘桂果蔗1号’>‘拔地拉’、‘闽引黄皮果蔗’>‘白玉果蔗’>‘川蔗26号’>‘龙黑果蔗’。‘桂果蔗1号’的综合评价值高达0.648，耐寒性最强；‘拔地拉’和‘闽引黄皮果蔗’的综合评价值都为0.464，耐寒性次之；‘龙黑果蔗’的综合评价值仅为0.355，耐寒性最差。

3 讨论与结论

植物细胞膜是一种选择透过性生物膜，逆境条件下细胞膜相对透性反映了膜系统稳定性^[13]。在评价植物耐寒性的生理生化指标中，质膜电解质渗出率(即REC)的大小是植物抗寒性强弱的重要指标，可用来判断植物受低温伤害程度和植物的抗寒能力^[14]。本研究表明，随着低温胁迫时间的延长，6个果蔗品种叶片REC均不断提高，但提高的幅度不同，说明低温胁迫对果蔗叶片细胞膜系统造成伤害，不同果蔗品种间抗寒性存在差异，这和黄杏等^[15]在甘蔗上的研究结果一致。MDA是膜脂过氧化的最终产物，对质膜有毒害作用，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度^[16]。植物的抗寒性与MDA含量呈负相关，即抗寒性越强，MDA含量越小，低温处理后，植物体内MDA含量会增加^[17]。本研究结果表明，随着低温胁迫时间的延长，6个果蔗品种叶片MDA含量呈先增加后降低的趋势，但均高于对照。

在逆境条件下，SS、SP和Pro等渗透调节物质的含量发生变化，植物体内各种渗透调节物质大量积累并导致细胞渗透势下降，从而增加其抗寒性^[18]。本研究表明，低温胁迫后，不同果蔗品种SP、SS和Pro含量均升高，这与唐仕云等^[19]的研究结果相似。低温胁迫下果蔗可通过增加体内主要渗透物质的含量来提高其对低温的适应性，抗寒性强的品种渗透物质含量增加的幅度大，反之，抗寒性弱的品种渗透物质含量增加的幅度较小。

低温胁迫下，植物体内产生大量的活性氧自由基，引发膜脂过氧化，同时植物体内还存在着SOD、POD、CAT和APX等抗氧化酶系统以清除活性氧、降低逆境损伤，酶活性的提高或降低与植物抗寒性的强弱有一定相关性^[20]。本研究表明，低温胁迫使果蔗SOD、POD、CAT和APX活性提高，有助于清除细胞内积累的自由基，从而减轻膜脂过氧化伤害，说明果蔗对低温产生了一定的抗性。但随着低温时间的延长，保护酶活性又有所降低，说明其清除自由基的能力下降，出现冻害症状。

植物的抗逆性是受多种因素影响的复杂的数量性状，不仅表现在形态上，同时也表现在生理生化过程中。用单一指标评价植物的抗逆性具有片面性，只有采用多个指标同时根据各自贡献率的大小进行综合评价才能准确反映植物的抗逆性^[21]。因此，在进行果蔗品种抗寒性鉴定时，不宜使用单一的生理生化指标，应采用多个指标综合评价。主成分分析可将原来个数较多的指标转换成为新的、个数较少且彼此独立的综合指标，适用于对植物抗寒性的综合评价分析^[22]。隶属函数法已经成功应用于甘蔗^[18]、小麦^[23]等作物的抗逆性评价，并证明其对抗性筛选的可靠性，可用于果蔗抗逆性的综合评价。本研究选择低温胁迫条件下与抗寒性密切相关的9项指标，利用主成分分析和隶属函数法对果蔗的抗寒性进行了综合评价，提高了抗寒性评价的准确性，该评价方法简便、准确，可作为果蔗抗寒能力鉴定的一种有效方法。

果蔗的抗寒性不仅与自身的遗传因素和生理特征有关，还与外界环境因素密切相关。选育抗寒性强的品种、建立良种良法配套的高产栽培技术，提高果蔗的抗寒综合能力，是目前果蔗在北方高效栽培生产中亟待解决的问题。本研究以生产上推广的6个果蔗品种为试材，综合分析结果表明，不同果蔗品种对长时间持续低温的适应能力各异，６个果蔗品种抗寒能力大小依次为：‘桂果蔗1号’>‘拔地拉’、‘闽引黄皮果蔗’>‘白玉果蔗’>‘川蔗26号’>‘龙黑果蔗’。