苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase，PAL)是苯丙氨酸代谢途径的关键酶和限速酶^[1]，只存在于微生物与植物中。在PAL作用下，苯丙烷类代谢完成第1步反应，生成香豆酸、阿魏酸和芥子酸等中间产物，这些中间产物进一步转化为香豆素和绿原酸，也可形成苯丙烷酸CoA酯，再进一步代谢转化为一系列苯丙素类化合物，如类黄酮、木质素和生物碱^[2]。因此，PAL基因在植物的代谢过程中起着重要作用。

20世纪70年代以来，越来越多的研究显示PAL基因与细胞分化存在一定相关性，愈伤组织分化过程中PAL活性增强，分化组织中有管状分子形成^[3]。章金明^[4]发现，当植物叶片受到机械损伤时，叶片PAL含量大幅增加，而且活性快速升高。苯丙烷类代谢产物经类黄酮途径产生黄酮类化合物，间接参与呼吸代谢，可作为植物体特殊贮能，帮助植物体清除自由基等。黄酮类化合物对根瘤菌有趋化作用^[5]，有些还可作为根瘤菌结瘤基因的诱导物质^[6]。此外，PAL基因在植物抗逆过程中也起着重要作用，研究发现多种植物受病原菌侵染后，PAL活性明显升高，并表现出规律性变化^[7-8]。欧芹Petroselinum crispum在受伤害或紫外线照射时PAL基因的转录水平提高^[9]，胡萝卜Daucus carota细胞受到UV-B照射时PAL基因对应的mRNA表达量会增加^[10]。

桉树Eucalyptus是原产于澳大利亚的树种，为当地重要的工业用材，具有速生和丰产的特点，相继被100多个国家引种。目前，尾叶桉E. urophylla是我国华南地区重要的纸浆材造林树种 ^[11]，也是一种比较理想的水土保持树种，具有美化和绿化环境的功能。此外，黄瑶等^[12]研究表明尾叶桉叶精油对某些常见菌有抑制效果。因此，研究尾叶桉抗逆性具有重要的经济、生态和社会效益。虽然目前已从多种植物中克隆出PAL基因，但在尾叶桉中鲜见有关PAL基因的相关报道。本研究以尾叶桉叶片为材料，开展尾叶桉PAL基因的克隆与表达分析，并进行DNA序列变异和系统进化等生物信息学方面的研究，解析PAL基因在尾叶桉抗逆过程中的作用。

1 材料与方法 1.1 试验材料

2009年，广东省林业科学研究院从尾叶桉自然分布区如澳洲大陆、新几内亚岛、印度尼西亚以及菲律宾等24个国家和地区收集了500个基因型的尾叶桉个体，种植于广东省肇庆市国有林场总场大南山林场，建立了尾叶桉种质资源库。本研究用于提取DNA的材料取自该基因库中24个种源的35个基因型个体。

用于提取RNA的材料来自广东省林业科学研究院内经水肥处理的16个月生尾叶桉无性系个体ZQUA44。水肥处理分为2部分：水分梯度处理和养分梯度处理。水分梯度处理分别为：梯度1，20%~40%田间持水量；梯度2，40%~60%田间持水量；梯度3，60%~80%田间持水量。养分梯度处理分别为：梯度1，基肥(钙镁磷肥250 g)；梯度2，基肥(钙镁磷肥250 g)，8月份施1次复合肥150 g，第2年春天施复合肥100 g；梯度3，基肥(钙镁磷肥250 g+复合肥150 g)，种植2个月后施尿素100 g，8月份施1次复合肥150 g，第2年春天施复合肥100 g。具体见表1。

1.2 试验方法 1.2.1 总DNA的提取

总DNA的提取按照Plant Genomic DNA Kit进行，试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2.2 RNA的提取和cDNA的合成

总RNA的提取按照RNAsimple Total RNA Kit进行，cDNA的合成按照Tiangen FastKing RT Kit进行，2种试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2.3 同源基因的获得

尾叶桉PAL同源基因从Phytozome网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/ portal.html)巨桉E. grandis基因序列数据库下载。与尾叶桉PAL基因同源的cDNA从NCBI数据库(https://www. ncbi.nlm.nih.gov/)下载。

1.2.4 引物设计及cDNA全长和基因全长扩增

利用NCBI Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_ LOC=BlastHome)网站，根据巨桉cDNA序列在其可能的开放阅读框两端设计引物：

PAL cDNA F：5′-GTTCTCCCTCGCCATTCTCC-3′；

PAL cDNA R：5′-TCAAAGCAAATACCACTCACGG-3′。

该基因较长，将其分成3段扩增。根据巨桉同源基因序列，在其开放阅读框两端分别设计引物：

PAL 1F：5′-CTTCGGTACGTTACCCACCC-3′；

PAL 1R：5′-ATCCGTGACGTGATTCCCTG-3′；

PAL 2F：5′-TGCGTCTTGTCAGGGAATCA-3′；

PAL 2R：5′-GCCGCCTTGACGTAAGAACT-3′；

PAL 3F：5′-TGCAGCTATCATGGAGCACA-3′；

PAL 3R：5′-TCGGAATGCTTTGTGCGGTA-3′。

本研究采用25 μL聚合酶链式反应(PCR)体系, 以尾叶桉叶片基因组DNA为模板，加入Taq PCR Master Mix (2×，blue dye) 12.5 μL，1 μL基因组DNA(5 μg·L^–1)，0.4 μmol·L^–1的正反向引物各2 μL，加适量蒸馏水至25 μL。于94 ℃条件下4 min；35个循环(94 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，90 s)；72 ℃，10 min。在此热循环条件下扩增出1 500 bp的DNA片段，然后通过拼接获得DNA全长。

1.2.5 逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测PAL基因在尾叶桉无性系不同处理中的表达模式

采用NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome) 网站设计扩增长度约200 bp的RT-qPCR引物，检测PAL基因在不同处理中的表达模式：

PAL RT-qPCR F：5′-ATCAGATTCTTGAACGCCGGT-3′；

PAL RT-qPCR R：5′-AAGTCACCAGAGGCGGAGAT-3′。

以肌动蛋白基因Actin作为内参，引物序列为：

Act F：5′-CTCCATCATGAAATGCGATG-3′；

Act R：5′-TTGGGGCTAGTGCTGAGATT-3′。

RT-qPCR反应按照FastKing RT Kit进行，试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。每个反应设置4个样品重复，4个内参对照重复。依次加入2×Talent RT-qPCR PreMix 10 μL, 10 μmol·L^–1的正反向引物各0.6 μL，cDNA 2 μL，添加RNase-Free dd H₂O至终体积为20 μL。RT-qPCR反应程序为：94 ℃，5 min；40个循环(94 ℃，30 s；60℃，30 s；72 ℃，30 s)。扩增结束后，通过溶解曲线检查引物的扩增特异性，然后应用7500Fast软件分析结果。

1.2.6 PAL基因的单核苷酸多态性(SNP)分析

以选取的35株个体的总DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行测序，然后将每一个基因片段的核苷酸序列拼接成完整的基因序列。利用MEGA6.0软件对PAL基因的35个序列进行比对分析，检测该基因的SNP。利用Dnasp4.90.1软件对该基因进行多态性分析，并进一步分析编码区和非编码区的SNP频率及编码区的同义突变和非同义突变情况，其中非同义突变又包括错义突变和无义突变等。

2 结果与分析 2.1 尾叶桉PAL同源cDNA的克隆及其结构特征

为了分离尾叶桉PAL基因的cDNA序列，本研究从巨桉全基因组上获得同源PAL基因序列。以此为基准设计引物，从尾叶桉叶片cDNA中扩增出PAL基因的氨基酸编码序列。对该序列测序后发现该序列与巨桉PAL基因序列相似度达96%，因此该序列即为尾叶桉EuuPAL基因序列。该序列共2 748 bp，包括166 bp的5′非编码区，411 bp的3′非编码区，以及2 172 bp的氨基酸编码序列。将获得的PAL基因氨基酸序列在NCBI上进行比对，并下载其他不同物种的氨基酸序列。对拟南芥Arabidopsis thaliana、大豆Clycine max、巨桉、葡萄Vitis vinifera和柑橘Citrus clementina等21个物种的氨基酸序列进行进化分析，发现尾叶桉与巨桉PAL基因亲缘关系最近，是同源基因(图1)。

根据cDNA序列信息设计引物，本研究从尾叶桉基因组DNA中克隆出PAL基因组序列全长，并对其进行分析。PAL基因组全长4 507 bp，包括166 bp的5′非编码区、411 bp的3′非编码区、2 172 bp的氨基酸编码序列(由2个外显子组成，分别为422 bp和1 750 bp)以及1 759 bp的内含子区域(图2)。

2.2 尾叶桉PAL基因在不同水肥处理中的表达模式

为了确定尾叶桉PAL基因在不同水肥处理中是否有差异性表达，我们提取尾叶桉9个处理的叶片RNA并反转录为cDNA进行RT-qPCR反应。结果表明PAL基因在AT4处理中表达量最高，AT2以及AT7处理次之，AT5处理表达量最低(图3)。

2.3 尾叶桉PAL基因的SNP分析

根据已知序列设计引物，对35株尾叶桉个体进行PCR扩增和序列分析。将比对的结果整理分析后发现，PAL基因全长4 507 bp，共有SNP位点307个，每15个碱基便出现1个多态性位点。在这些SNP位点中，频率最高的(7 bp^–1)出现在内含子区域，频率最低的(194 bp^–1)出现在外显子区域(表2)。这和预期的生物在选择压下编码区会高度保守一致。在外显子区域共24个SNP位点，其中21个为同义突变，3个为非同义突变(表3)。总体来说，PAL基因具有较大多态性，SNP系数π_T和θ_w分别为0.036 46和0.049 2。基因不同结构区域多态性系数差异很大，在第1个外显子区域多态性比较小，多态性系数π_T和θ_w分别为0.064 85和0.082 3；在内含子区域多态性比较大，多态性系数π_T和θ_w分别为0.071 36和0.099 1(表2)。

碱基之间存在2种突变类型：转换和颠换。转换是嘌呤与嘌呤之间或者嘧啶与嘧啶之间的突变；颠换是嘌呤与嘧啶之间的突变。PAL基因中的307个SNP位点包括202个转换突变(89个A/G转换、113个T/C转换)和105个颠换突变(31个A/C颠换、21个T/G颠换、28个A/T颠换、25个G/C颠换)。

3 讨论与结论 3.1 尾叶桉PAL基因的进化分析与SNP分析

将克隆出来的尾叶桉PAL基因的氨基酸序列在NCBI中进行比对，发现尾叶桉PAL基因与巨桉相似性最高，印证了尾叶桉与巨桉的亲缘关系。对该基因进行SNP分析发现共有307个多态性位点，多态性程度较高。但多数多态性位点都出现在内含子区域(即非编码区域)，该区域的SNP变异一般不会直接影响PAL基因的正常表达与PAL正常催化功能。外显子区域24个多态性位点中21个是同义突变，仅3个是错义突变，并且均属于罕见突变位点。因此总体来说尾叶桉PAL基因在长期进化过程中保持着比较稳定的遗传，这一结果与前人研究一致^[13]。

在自然界中，约有一半以上的SNP突变是T/C转换或者反义的A/G转换。人类每3个SNP突变中就有2个是T/C或者A/G转换，小麦和玉米大约有45%和55%的SNP突变是T/C或A/G转换。发生这一现象的原因在于甲基化的核苷酸C在去氨基化后，容易被DNA聚合酶误读为T^[14]，因此可以根据T/C或者A/G转换的比例来判断测序结果是否可信。通过对PAL基因 2种碱基变换形式的分析发现，A/G和T/C转换的突变频率(28.99%和36.81%)远大于A/C、T/G、A/T和G/C颠换的突变频率(10.10%、6.84%、9.12%和8.14%)。T/C和A/G转换的比例大概占65.80%，与人类T/C和A/G转换的比例相近。

3.2 PAL基因在尾叶桉抗逆性方面的作用

大量研究表明，PAL基因参与植物的多种抗逆活动，如抗病^[15-19]和抗虫^[20-21]等。为了研究尾叶桉PAL基因与其抗逆性是否相关，此次试验运用了2个变量来研究尾叶桉PAL基因表达与抗逆性的关系。结果表明，PAL基因在AT5处理的表达量与对照一致，且AT5处理表型数据也与对照一致，说明AT5处理已能满足尾叶桉生长对水分和养分的需求。AT4处理中PAL基因表达量最高，说明在水分相同情况下，养分的短缺成为影响尾叶桉幼苗生长的重要因素。因此PAL基因可能参与了尾叶桉对逆境的响应过程。AT2与AT7处理中PAL基因表达量基本一致，均高于对照2倍，说明在这2种处理下植物受到一定程度的胁迫，但胁迫程度低于AT4处理。因此植物的生长受到水分和养分的联合作用。