苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)是苯丙氨酸代谢途径的关键酶和限速酶[1],只存在于微生物与植物中。在PAL作用下,苯丙烷类代谢完成第1步反应,生成香豆酸、阿魏酸和芥子酸等中间产物,这些中间产物进一步转化为香豆素和绿原酸,也可形成苯丙烷酸CoA酯,再进一步代谢转化为一系列苯丙素类化合物,如类黄酮、木质素和生物碱[2]。因此,PAL基因在植物的代谢过程中起着重要作用。
20世纪70年代以来,越来越多的研究显示PAL基因与细胞分化存在一定相关性,愈伤组织分化过程中PAL活性增强,分化组织中有管状分子形成[3]。章金明[4]发现,当植物叶片受到机械损伤时,叶片PAL含量大幅增加,而且活性快速升高。苯丙烷类代谢产物经类黄酮途径产生黄酮类化合物,间接参与呼吸代谢,可作为植物体特殊贮能,帮助植物体清除自由基等。黄酮类化合物对根瘤菌有趋化作用[5],有些还可作为根瘤菌结瘤基因的诱导物质[6]。此外,PAL基因在植物抗逆过程中也起着重要作用,研究发现多种植物受病原菌侵染后,PAL活性明显升高,并表现出规律性变化[7-8]。欧芹Petroselinum crispum在受伤害或紫外线照射时PAL基因的转录水平提高[9],胡萝卜Daucus carota细胞受到UV-B照射时PAL基因对应的mRNA表达量会增加[10]。
桉树Eucalyptus是原产于澳大利亚的树种,为当地重要的工业用材,具有速生和丰产的特点,相继被100多个国家引种。目前,尾叶桉E. urophylla是我国华南地区重要的纸浆材造林树种 [11],也是一种比较理想的水土保持树种,具有美化和绿化环境的功能。此外,黄瑶等[12]研究表明尾叶桉叶精油对某些常见菌有抑制效果。因此,研究尾叶桉抗逆性具有重要的经济、生态和社会效益。虽然目前已从多种植物中克隆出PAL基因,但在尾叶桉中鲜见有关PAL基因的相关报道。本研究以尾叶桉叶片为材料,开展尾叶桉PAL基因的克隆与表达分析,并进行DNA序列变异和系统进化等生物信息学方面的研究,解析PAL基因在尾叶桉抗逆过程中的作用。
1 材料与方法 1.1 试验材料2009年,广东省林业科学研究院从尾叶桉自然分布区如澳洲大陆、新几内亚岛、印度尼西亚以及菲律宾等24个国家和地区收集了500个基因型的尾叶桉个体,种植于广东省肇庆市国有林场总场大南山林场,建立了尾叶桉种质资源库。本研究用于提取DNA的材料取自该基因库中24个种源的35个基因型个体。
用于提取RNA的材料来自广东省林业科学研究院内经水肥处理的16个月生尾叶桉无性系个体ZQUA44。水肥处理分为2部分:水分梯度处理和养分梯度处理。水分梯度处理分别为:梯度1,20%~40%田间持水量;梯度2,40%~60%田间持水量;梯度3,60%~80%田间持水量。养分梯度处理分别为:梯度1,基肥(钙镁磷肥250 g);梯度2,基肥(钙镁磷肥250 g),8月份施1次复合肥150 g,第2年春天施复合肥100 g;梯度3,基肥(钙镁磷肥250 g+复合肥150 g),种植2个月后施尿素100 g,8月份施1次复合肥150 g,第2年春天施复合肥100 g。具体见表1。
总DNA的提取按照Plant Genomic DNA Kit进行,试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。
1.2.2 RNA的提取和cDNA的合成总RNA的提取按照RNAsimple Total RNA Kit进行,cDNA的合成按照Tiangen FastKing RT Kit进行,2种试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司。
1.2.3 同源基因的获得尾叶桉PAL同源基因从Phytozome网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/ portal.html)巨桉E. grandis基因序列数据库下载。与尾叶桉PAL基因同源的cDNA从NCBI数据库(https://www. ncbi.nlm.nih.gov/)下载。
1.2.4 引物设计及cDNA全长和基因全长扩增利用NCBI Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_ LOC=BlastHome)网站,根据巨桉cDNA序列在其可能的开放阅读框两端设计引物:
PAL cDNA F:5′-GTTCTCCCTCGCCATTCTCC-3′;
PAL cDNA R:5′-TCAAAGCAAATACCACTCACGG-3′。
该基因较长,将其分成3段扩增。根据巨桉同源基因序列,在其开放阅读框两端分别设计引物:
PAL 1F:5′-CTTCGGTACGTTACCCACCC-3′;
PAL 1R:5′-ATCCGTGACGTGATTCCCTG-3′;
PAL 2F:5′-TGCGTCTTGTCAGGGAATCA-3′;
PAL 2R:5′-GCCGCCTTGACGTAAGAACT-3′;
PAL 3F:5′-TGCAGCTATCATGGAGCACA-3′;
PAL 3R:5′-TCGGAATGCTTTGTGCGGTA-3′。
本研究采用25 μL聚合酶链式反应(PCR)体系, 以尾叶桉叶片基因组DNA为模板,加入Taq PCR Master Mix (2×,blue dye) 12.5 μL,1 μL基因组DNA(5 μg·L–1),0.4 μmol·L–1的正反向引物各2 μL,加适量蒸馏水至25 μL。于94 ℃条件下4 min;35个循环(94 ℃,30 s;60 ℃,30 s;72 ℃,90 s);72 ℃,10 min。在此热循环条件下扩增出1 500 bp的DNA片段,然后通过拼接获得DNA全长。
1.2.5 逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测PAL基因在尾叶桉无性系不同处理中的表达模式采用NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome) 网站设计扩增长度约200 bp的RT-qPCR引物,检测PAL基因在不同处理中的表达模式:
PAL RT-qPCR F:5′-ATCAGATTCTTGAACGCCGGT-3′;
PAL RT-qPCR R:5′-AAGTCACCAGAGGCGGAGAT-3′。
以肌动蛋白基因Actin作为内参,引物序列为:
Act F:5′-CTCCATCATGAAATGCGATG-3′;
Act R:5′-TTGGGGCTAGTGCTGAGATT-3′。
RT-qPCR反应按照FastKing RT Kit进行,试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。每个反应设置4个样品重复,4个内参对照重复。依次加入2×Talent RT-qPCR PreMix 10 μL, 10 μmol·L–1的正反向引物各0.6 μL,cDNA 2 μL,添加RNase-Free dd H2O至终体积为20 μL。RT-qPCR反应程序为:94 ℃,5 min;40个循环(94 ℃,30 s;60℃,30 s;72 ℃,30 s)。扩增结束后,通过溶解曲线检查引物的扩增特异性,然后应用7500Fast软件分析结果。
1.2.6 PAL基因的单核苷酸多态性(SNP)分析以选取的35株个体的总DNA为模板进行PCR扩增,对PCR扩增产物进行测序,然后将每一个基因片段的核苷酸序列拼接成完整的基因序列。利用MEGA6.0软件对PAL基因的35个序列进行比对分析,检测该基因的SNP。利用Dnasp4.90.1软件对该基因进行多态性分析,并进一步分析编码区和非编码区的SNP频率及编码区的同义突变和非同义突变情况,其中非同义突变又包括错义突变和无义突变等。
2 结果与分析 2.1 尾叶桉PAL同源cDNA的克隆及其结构特征为了分离尾叶桉PAL基因的cDNA序列,本研究从巨桉全基因组上获得同源PAL基因序列。以此为基准设计引物,从尾叶桉叶片cDNA中扩增出PAL基因的氨基酸编码序列。对该序列测序后发现该序列与巨桉PAL基因序列相似度达96%,因此该序列即为尾叶桉EuuPAL基因序列。该序列共2 748 bp,包括166 bp的5′非编码区,411 bp的3′非编码区,以及2 172 bp的氨基酸编码序列。将获得的PAL基因氨基酸序列在NCBI上进行比对,并下载其他不同物种的氨基酸序列。对拟南芥Arabidopsis thaliana、大豆Clycine max、巨桉、葡萄Vitis vinifera和柑橘Citrus clementina等21个物种的氨基酸序列进行进化分析,发现尾叶桉与巨桉PAL基因亲缘关系最近,是同源基因(图1)。
根据cDNA序列信息设计引物,本研究从尾叶桉基因组DNA中克隆出PAL基因组序列全长,并对其进行分析。PAL基因组全长4 507 bp,包括166 bp的5′非编码区、411 bp的3′非编码区、2 172 bp的氨基酸编码序列(由2个外显子组成,分别为422 bp和1 750 bp)以及1 759 bp的内含子区域(图2)。
为了确定尾叶桉PAL基因在不同水肥处理中是否有差异性表达,我们提取尾叶桉9个处理的叶片RNA并反转录为cDNA进行RT-qPCR反应。结果表明PAL基因在AT4处理中表达量最高,AT2以及AT7处理次之,AT5处理表达量最低(图3)。
根据已知序列设计引物,对35株尾叶桉个体进行PCR扩增和序列分析。将比对的结果整理分析后发现,PAL基因全长4 507 bp,共有SNP位点307个,每15个碱基便出现1个多态性位点。在这些SNP位点中,频率最高的(7 bp–1)出现在内含子区域,频率最低的(194 bp–1)出现在外显子区域(表2)。这和预期的生物在选择压下编码区会高度保守一致。在外显子区域共24个SNP位点,其中21个为同义突变,3个为非同义突变(表3)。总体来说,PAL基因具有较大多态性,SNP系数πT和θw分别为0.036 46和0.049 2。基因不同结构区域多态性系数差异很大,在第1个外显子区域多态性比较小,多态性系数πT和θw分别为0.064 85和0.082 3;在内含子区域多态性比较大,多态性系数πT和θw分别为0.071 36和0.099 1(表2)。
碱基之间存在2种突变类型:转换和颠换。转换是嘌呤与嘌呤之间或者嘧啶与嘧啶之间的突变;颠换是嘌呤与嘧啶之间的突变。PAL基因中的307个SNP位点包括202个转换突变(89个A/G转换、113个T/C转换)和105个颠换突变(31个A/C颠换、21个T/G颠换、28个A/T颠换、25个G/C颠换)。
3 讨论与结论 3.1 尾叶桉PAL基因的进化分析与SNP分析将克隆出来的尾叶桉PAL基因的氨基酸序列在NCBI中进行比对,发现尾叶桉PAL基因与巨桉相似性最高,印证了尾叶桉与巨桉的亲缘关系。对该基因进行SNP分析发现共有307个多态性位点,多态性程度较高。但多数多态性位点都出现在内含子区域(即非编码区域),该区域的SNP变异一般不会直接影响PAL基因的正常表达与PAL正常催化功能。外显子区域24个多态性位点中21个是同义突变,仅3个是错义突变,并且均属于罕见突变位点。因此总体来说尾叶桉PAL基因在长期进化过程中保持着比较稳定的遗传,这一结果与前人研究一致[13]。
在自然界中,约有一半以上的SNP突变是T/C转换或者反义的A/G转换。人类每3个SNP突变中就有2个是T/C或者A/G转换,小麦和玉米大约有45%和55%的SNP突变是T/C或A/G转换。发生这一现象的原因在于甲基化的核苷酸C在去氨基化后,容易被DNA聚合酶误读为T[14],因此可以根据T/C或者A/G转换的比例来判断测序结果是否可信。通过对PAL基因 2种碱基变换形式的分析发现,A/G和T/C转换的突变频率(28.99%和36.81%)远大于A/C、T/G、A/T和G/C颠换的突变频率(10.10%、6.84%、9.12%和8.14%)。T/C和A/G转换的比例大概占65.80%,与人类T/C和A/G转换的比例相近。
3.2 PAL基因在尾叶桉抗逆性方面的作用大量研究表明,PAL基因参与植物的多种抗逆活动,如抗病[15-19]和抗虫[20-21]等。为了研究尾叶桉PAL基因与其抗逆性是否相关,此次试验运用了2个变量来研究尾叶桉PAL基因表达与抗逆性的关系。结果表明,PAL基因在AT5处理的表达量与对照一致,且AT5处理表型数据也与对照一致,说明AT5处理已能满足尾叶桉生长对水分和养分的需求。AT4处理中PAL基因表达量最高,说明在水分相同情况下,养分的短缺成为影响尾叶桉幼苗生长的重要因素。因此PAL基因可能参与了尾叶桉对逆境的响应过程。AT2与AT7处理中PAL基因表达量基本一致,均高于对照2倍,说明在这2种处理下植物受到一定程度的胁迫,但胁迫程度低于AT4处理。因此植物的生长受到水分和养分的联合作用。
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