2018, Vol. 39
2. 中山广食农牧发展有限公司，广东 中山 528451
2. Zhongshan Guangshi Agriculture and Animal Husbandry Development Company, Zhongshan 528451, China
口蹄疫Aphtae epizooticae是由口蹄疫病毒Aphthovirus(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的一种热性、急性、人畜共患传染病[1]。该病具有传播速度快、病原变异快、血清型种类多等特点, 加上该病发病率较高，对我国的畜牧贸易造成了巨大的经济损失。因此，做好该病的防控具有重要的意义。
FMDV VP1基因的变异程度最大，编码的VP1蛋白是参与形成抗原位点的最主要的机构蛋白。在FMDV分型中，可以通过分析VP1基因的核苷酸序列差异建立遗传进化树来进行分型。3A基因是一种膜相关蛋白，其C段易突变，在病毒RNA的复制中起重要作用[2]。3A蛋白的氨基酸变化与FMDV的宿主嗜性及毒力相关。分析3A蛋白的遗传变异趋势，有可能预测病毒在宿主范围和毒力方面的变化[3]。本研究通过对广东部分地区FMDV进行抗体检测和对VP1和3A基因进行序列分析，旨在丰富广东地区FMDV流行病学资料，为临床上不同疫苗毒株的选择提供参考信息。
1 材料与方法 1.1 病料来源18份临床样品采集自广东省2015—2016年临床症状疑似FMDV感染的猪蹄部水泡液。
1.2 主要试剂Ex Taq DNA聚合酶、AMV反转录酶、DL2000 Marker、pMD18-T载体均购自宝生物工程(大连) 有限公司；TRIzol试剂盒购自Invitrogen公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Omega公司；DH-5α 感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司。
1.3 引物设计根据GenBank中发表的FMDV基因组序列，设计扩增FMDV VP1(835 bp)和3A基因(830 bp)的引物，包括VP1-F：5′-GTGCYGGCAARCACTTTGA-3′；VP1-R: 5′-CACATGTTCTCTTGCATCTG-3′；3A-F：5′-ACGACGTCYCARTACGTT-3′；3A-R：5′-ACCTTCAAAGTGACAGGYT-3′。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
1.4 基因扩增和克隆将采集的病料浸出液，按照TRIzol Reagent RNA提取试剂盒的使用说明书操作，提取病毒总RNA[4]。以其为模板，采用MLV反转录酶进行反转录制备cDNA。以cDNA为模板，VP1-F/R与3A-F/R为引物，合成VP1基因与3A基因。参数为：95 ℃ 4 min，1个循环；94 ℃ 1 min，54 ℃ 50 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物进行回收纯化[5]。克隆于pMD18-T载体中，阳性重组质粒送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。
1.5 序列分析参考GenBank登录的国内外FMDV参考病毒株序列[6]和NCBI Blast结果，利用DNAStar、ClustalX、MEGA5.1、MegAlign软件对不同病毒株的VP1和3A基因序列进行比较分析，绘制基于VP1和3A基因的FMDV遗传进化树[7]。
2 结果与分析 2.1 VP1和3A基因片段的扩增用针对VP1和3A基因特异性的引物对临床采集的具有水疱症状的样品(水泡液及水泡皮)进行RT-PCR验证，所扩增的VP1和3A基因与预期长度一致[8](图1)。
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图 1 VP1和3A基因的RT-PCR扩增产物 Figure 1 The RT-PCR amplification products of VP1 and 3A genes M：DL2000 Marker；N：阴性对照 |
将VP1基因序列用NCBI Blast进行联机检索，结果显示7个分离株属于A型毒株, 包括GD-MC-1、GD-MC-2、GD-ZS-1、GD-ZS-2、GD-CH-1、GD-3和GD-4；11个分离株属于O型毒株[9]，包括GD-MM-1、GD-MM-2、GD-MM-3、GD-MM-4、GD-MM-5、GD-MM-6、GD-QY-1、GD-JM-1、GD-1、GD-2和GD-KPYC。
2.3 O型FMDV VP1和3A基因的序列分析 2.3.1 基于VP1基因的O型FMDV遗传进化分析基于VP1基因序列，用MEGA 6.0软件对2015—2016年11株O型FMDV与其他11株FMDV的参考株进行了遗传进化分析(图2)，结果表明11株O型FMDV均在ESA分支上，均属耿马谱系毒株。GD-1株和GD-2株与O/GZ/CHA/2010株遗传进化关系较近。
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图 2 基于VP1基因的O型FMDV的遗传进化树 Figure 2 Phylogenetic tree of the nucleotide sequence of type O FMDV based on VP1 gene 带有实心圆形标记的序列为本试验测得的序列，其他序列源于GenBank[6] |
对2015—2016年11株O型FMDV的VP1基因，用DNAStar软件与其他11株FMDV的参考株进行了序列比对分析，结果表明11株O型FMDV的VP1基因之间的序列相似性为95.3%~99.8%。O/BY/CHA/2010株与GD/MM/3株序列相似性最高，为95.3%。O/MYA/1/98株与GD/1株、GD/MM/1株和GD/MM/3株序列相似性最高，为90.8%。这11株O型FMDV与O/HK/2001株序列相似性较低，为75.4%~78.2%。
2.3.3 O型FMDV VP1蛋白氨基酸位点变异性分析对2015—2016年11株O型FMDV的VP1蛋白，用MegAlign软件进行氨基酸位点变异性分析，用O/MYA/1/98株作为FMDV的参考株。结果表明，O型FMDV的VP1蛋白的高突变区分布在47~51、153~156 aa。
2.3.4 基于3A基因的O型FMDV遗传进化分析基于3A基因序列，用MEGA 6.0软件对2015—2016年11株O型FMDV与其他7株FMDV的参考株进行了遗传进化分析(图3)，结果表明11株O型FMDV分为2个分支，其中有9株与O/BY/CHA/2010株在1个分支；另外2株与O/TAW/2/99/TC株分布在1个分支。11株FMDV的3A基因均不存在缺失。
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图 3 基于3A基因的O型FMDV的遗传进化树 Figure 3 Phylogenetic tree of type O FMDV based on 3A gene 带有实心圆形标记的序列为本试验测得的序列，其他序列源于GenBank[6] |
对2015—2016年11株O型FMDV的3A基因，用DNAStar软件与其他7株FMDV的参考株进行了序列比对分析，结果表明11株O型FMDV的3A基因之间的序列相似性为87.1%~98.0%。O/BY/CHA/2010株与GD-1株和GD-2株的序列相似性最高，为95.2%。O/GZ/CHA/2010株与GD-1株和GD-2株序列相似性最高，为93.9%。
2.3.6 O型FMDV 3A蛋白氨基酸位点变异性分析对2015—2016年11株O型FMDV的3A蛋白，用MegAlign软件进行氨基酸位点变异性分析，用O/BY/CHA/2010株作为FMDV的参考株。结果表明，Cathay分支上的毒株出现氨基酸的缺失，因此FMDV也可以按是否出现氨基酸缺失分为2个组群，即第Ⅰ组群为新毒株谱系毒株，第Ⅱ组群为耿马谱系新毒株和泛亚谱系毒株。O型FMDV的3A蛋白的高突变区分布在125~152 aa。
2.4 A型FMDV VP1和3A基因的序列分析 2.4.1 基于VP1基因的A型FMDV遗传进化分析基于VP1基因序列，用MEGA 6.0软件对2015—2016年7株A型FMDV与其他15株FMDV的参考株进行了遗传进化分析(图4)，结果表明，这7株A型FMDV与A/GDMM/CHA/2013株、A/HuBWH/CHA/2009株在同一个大分支上，均属Asia型毒株。这7株A型FMDV中GD-3株与A/GDMM/CHA/2013株的遗传进化关系最近。A/HuBWH/CHA/2009株与这7株A型FMDV的遗传进化关系相对较远。
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图 4 基于VP1基因的A型FMDV的遗传进化树 Figure 4 Phylogenetic tree of type A FMDV based on VP1 gene 带有实心圆形标记的序列为本试验测得的序列，其他序列来源于GenBank[6] |
对2015—2016年7株A型FMDV的VP1基因，用DNAStar软件与其他7株FMDV的参考株进行了序列比对分析, 结果表明，7株A型FMDV的VP1基因之间的序列相似性为95.6%~99.7%。A/GDMM/CHA/2013株与GD-3株的序列相似性最高，为99.8%；A/GDMM/CHA/2013株与GD-CH-1株的序列相似性最低，为96.4%。A/HuBWH/CHA/2009株与GD-3株的序列相似性最高，为91.4%；A/HuBWH/CHA/2009株与GD-CH-1株的序列相似性最低，为88.4%。
2.4.3 A型FMDV VP1蛋白氨基酸位点变异性分析对2015—2016年7株A型FMDV的VP1蛋白，用MegAlign软件进行氨基酸位点变异性分析，用A/GDMM/CHA/2013株作为FMDV的参考株。结果表明，FMDV VP1蛋白的高突变区分布在43~47、138~143、151~156、163~173 aa。
2.4.4 基于3A基因的A型FMDV遗传进化分析基于3A基因序列，用MEGA 6.0软件对2015—2016年7株A型FMDV与其他12株FMDV的参考株进行了遗传进化分析(图5)，结果表明，这7株A型FMDV与参考株分成了2个组群，根据这7株A型FMDV氨基酸位点变异性分析可知，本次检测的7株A型FMDV均属于Ⅰ型毒株，即3A基因有22个碱基缺失，而Ⅱ型毒株的3A基因只有3个碱基连续缺失。
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图 5 基于3A基因的A型FMDV的遗传进化树 Figure 5 Phylogenetic tree of type A FMDV based on 3A gene 带有实心圆形标记的序列为本试验测得的序列，其他序列来源于GenBank[6] |
对2015—2016年7株A型FMDV的3A基因，用DNAStar软件与其他12株FMDV的参考株进行了序列比对分析，结果表明，7株A型FMDV的3A基因之间的序列相似性为96.1%~99.8%。A/airan/iso105株与GD-MC-1株和GD-MC-2株的序列相似性最高，为92.8%；A/airan/iso105株与GD-ZS-1株和GD-MC-2株的序列相似性最低，为90.4%。这7株A型FMDV的3A基因与A/VN/03/2009株和A/VN/03/2009的序列相似性较低，为41.7%~42.8%。
2.4.6 A型FMDV 3A蛋白氨基酸位点变异性分析对2015—2016年7株A型FMDV的3A蛋白，用MegAlign软件进行氨基酸位点变异性分析，用A/TUR/43/95株作为FMDV的参考株。结果同样表明，7株A型FMDV均属Ⅰ型毒株，其3A蛋白氨基酸存在较多缺失。Ⅱ型毒株的3A蛋白只有1个氨基酸的缺失。
3 讨论与结论2015—2016年间检测到的11株O型FMDV属于耿马谱系，与历年流行毒株相似性均低于95%。氨基酸突变位点集中于138~139，153~156 aa，位于RGD两侧决定病毒感染细胞特性的关键区域[10]。O型FMDV的3A基因未发现氨基酸缺失。7株A型FMDV同属于Asia型，变异程度相对较低，为96.4%~99.8%，氨基酸变异同样包括了RGD两侧的138~139，153~156 aa区域[11]。7株A型口蹄疫3A基因均出现了不同程度的缺失。
华南地区在2010年以前，口蹄疫流行毒株均为新毒株谱系或泛亚谱系，2010年后耿马谱系毒株在广东猪群大规模流行[12]。石庆伟等[13]于2014年检出2株O型耿马系FMDV和本研究检出的11株O型耿马系FMDV突变程度大，说明了广东地区耿马系毒株开始大规模流行。A型口蹄疫近年来被官方报道流行于新疆、西藏和云南等地[14]。石庆伟等[13]于2014年检出3株A型口蹄疫，2015—2016年检测到7株A型FMDV，A型毒株在广东地区同样呈现流行趋势。广东部分地区口蹄疫病毒基因型复杂基因变异情况复杂，原有基因型FMDV未得到有效控制，新发基因型相继流行，由此导致广东地区FMDV预防控制困难[15]。
本研究通过对FMDV遗传进化分析为我国FMDV流行病学的研究提供了基础数据，同时为临床上不同型疫苗的选择提供依据。
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