黄梁木Neolamarckia cadamba又名团花树，属茜草科Rubiaceae团花属Neolamarckia树种，常绿或半落叶高乔木，为我国南亚热带和热带乡土阔叶树种。黄梁木生长速度快，10年左右即可成材，被誉为“奇迹树”^[1-2]。其树干通直、圆满，材质良好，可用作门窗、天花板等轻型建筑材料，也是纤维板、胶合板和人造纤维、造纸等木材工业的理想原料^[3]。黄梁木叶具有叶片大、粗蛋白含量高、营养成分丰富、饲料生物量高等特点，是一种潜在的饲料资源。鲜黄梁木叶水分含量高，在自然干燥时对天气条件要求高，尤其在南方多雨季节更不易实现，因此，青贮是最适宜的贮藏方式。青贮是将青绿饲料经乳酸菌发酵从而达到长期保存饲料营养成分的技术，其发酵过程复杂，青贮品质受到多种因素的影响^[4-5]。研究表明，在青贮过程中合理使用添加剂可以改善青贮效果，获得优质的青贮饲料^[6-7]。乳酸菌、甲酸是目前国内外普遍使用的高效添加剂^[8]。添加乳酸菌能大大提高青贮发酵初期的乳酸菌基数，促进发酵速度，有效降低青贮饲料的pH和氨态氮含量，增加乳酸含量；添加甲酸能抑制不良微生物的生长，有效保存可溶性糖，同时降低氨态氮的含量^[9]。除添加剂外，青贮原料本身的含水量也是影响青贮品质的重要因素，含水量太高，青贮过程中会产生大量渗出液，易引起梭菌发酵；含水量太低，不利于压实，引起好氧霉变，使营养物质大量损失^[10-11]。目前，国内外开展的青贮研究多集中于苜蓿、燕麦、玉米等常规饲料上，对黄梁木叶的青贮研究鲜见报道。

本文通过黄梁木叶青贮试验，研究了2种含水量条件下3种添加剂青贮对其化学成分和青贮品质的影响，探索黄梁木叶作为青贮原料的可行性，旨在为调制品质优良的青贮饲料提供理论依据和技术参考，并为木本饲料资源的开发利用提供途径和方法。

植物材料：于2016年5月在华南农业大学增城试验基地的黄梁木饲用试验林采集鲜叶，自然晾晒3和12 h，含水量(w)分别降至80%和70%，剪短为1~2 cm备用。

添加剂：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum (LP)，添加量为1×10⁶ cfu·g^–1，由中国农业大学青贮实验室研发，从青贮饲料中分离；壮乐美青贮发酵剂(ZLM)，主要成分有L. plantarum 550、L. plantarum 360、L. sbuchneri 225和纤维素酶，添加量为0.005 g·kg^–1，由四川高福记食品有限公司提供；甲酸(FA)，添加量为3 g·kg^–1。

试验采用2×4双因素完全随机设计，一个因素是含水量，设2个水平，即w分别为80%和70%，另一因素为添加剂处理。将2个含水量条件下的黄梁木叶分别进行无添加(对照，CK)、FA、LP和ZLM处理，将其充分混匀后，取170 g左右装入聚乙烯真空包装袋中，用真空包装机真空封口，每个处理设置3个重复，共24袋，室温青贮60 d后开袋，对其化学成分、发酵品质进行测定分析。

开袋后，取代表性青贮样品20 g，加入180 mL蒸馏水，混合均匀，经家用榨汁机榨汁1 min，依次用4层纱布和中速定性滤纸过滤，得到浸提液，采用pH计(PHS-3C，上海雷磁)测量pH^[12]。缓冲能值(Buffering capacity)采用滴定法测定，利用乳酸进行标定^[13]。浸提液经0.22 μm孔径的滤膜过滤得到滤液，采用岛津GC-14型高效液相色谱仪(色谱柱：Shodex Rspak KC-811 s-DVB gel column，日本；检测器：SPD-M10AVP)测定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量，流动相为3 mmol·L^–1高氯酸，流速1 mL·min^–1；柱温50 ℃；检测波长210 nm，进样量5 μL^[14]。采用苯酚–次氯酸比色法测定氨态氮(NH₄⁺-N)含量^[15]。

称取130 g左右的鲜样，利用鼓风干燥箱在65 ℃恒温条件下，干燥48 h，冷却，称质量，计算干物质含量；利用FOSS 8400全自动凯氏定氮仪测定粗蛋白和总氮(TN)含量，结果用质量分数表示^[16]；采用蒽酮–硫酸比色法测定可溶性碳水化合物含量；配制中性洗涤剂(w为3%的十二烷基硫酸钠)和酸性洗涤剂(w为2%的十六烷三甲基溴化铵)以及φ为72%的硫酸溶液，利用Ankom 220型纤维分析系统测定中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、纤维素、半纤维素和酸性洗涤木质素含量，结果用质量分数表示^[16-17]。

取代表性样品20 g，加入180 mL灭菌的生理盐水，均匀混合后逐级稀释。微生物数量采用平板计数法测定，以cfu·g^–1表示，乳酸菌、大肠埃希菌和酵母菌分别采用MRS琼脂培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂培养基(VRBA)和孟加拉红培养基(虎红琼脂)进行培养^[18]。

应用Excel 2007对数据进行初步整理，再以SAS 9.3软件对试验结果进行双因素方差分析和Duncan’s多重比较。

青贮进行前，取未晾晒的黄梁木叶测定原料中的化学成分含量，结果见表1。由表1可知，黄梁木叶中的干物质质量分数为28.22%。干物质中，粗蛋白、可溶性碳水化合物、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的质量分数分别为22.89%、4.76%、32.84%和24.91%。黄梁木叶青贮原料缓冲能为29.28 g·kg^–1。

表 1 Table 1

表 1 黄梁木叶青贮原料化学成分 Table 1 The chemical compositions of Neolamarckia cadamba leaves before ensiling 化学成分 w1)/% 粗蛋白 22.89±1.06 可溶性碳水化合物 4.76±0.61 中性洗涤纤维 32.84±3.63 酸性洗涤纤维 24.91±3.81 纤维素 11.91±0.57 半纤维素 7.92±0.40 木质素 11.26±3.25 w(干物质)/% 28.22±3.18 缓冲能/(g·kg–1) 29.28±1.18 　1) 表中数据为平均值±标准误；各化学成分均为占干物质的质量分数

表 1 黄梁木叶青贮原料化学成分 Table 1 The chemical compositions of Neolamarckia cadamba leaves before ensiling

如表2所示，双因素方差分析表明，含水量和添加剂对黄梁木叶青贮后的pH和乙酸含量有极显著影响(P<0.01)，但对乳酸含量和w(NH₄⁺-N)/w(TN)影响不显著(P>0.05)；两者的交互作用对乳酸、乙酸和丙酸含量影响极显著(P<0.01)，但对pH和NH₃-N/TN比值无显著影响(P>0.05)。在80%含水量条件下，3种添加剂对乳酸含量无显著影响(P>0.05)，但极显著降低了黄梁木叶的pH(P<0.01)，其中LP处理的pH最低，同时，LP处理下未检测到乙酸；3种添加剂处理组的丙酸含量与CK相比差异极显著(P<0.01)。在70%含水量条件下，LP和ZLM处理均显著降低了黄梁木叶的pH以及乳酸和丙酸含量，其中LP处理对pH的影响极显著(P<0.01)；FA处理下，pH和乳酸含量较CK增加，但差异不显著(P>0.05)；FA和ZLM处理组的乙酸含量较CK极显著增加(P<0.01)。所有处理条件下均未检测到丁酸，且对w(NH₃-N)/w(TN)无显著影响(P>0.05)。

表 2 Table 2

表 2 不同处理黄梁木叶青贮饲料的pH、有机酸含量和w(NH4+-N)/w(TN)1) Table 2 pH values, organic acid contents and ammonia nitrogen/total nitrogen ratios of Neolamarckia cadamba leaf silage in different treatments 处理 pH w干/% w(NH4+-N)/ w(TN) 含水量(w)/% 添加剂 乳酸 乙酸 丙酸 丁酸 80 CK 4.18±0.03Aa 5.37±1.12ABab 0.88±0.23Aa 0.17±0.02Bb ··· 0.21±0.01a FA 4.06±0.04Bb 4.02±0.56Bb 0.81±0.05Aa 0.10±0.01Cc ··· 0.15±0.11a LP 3.92±0.04Cc 5.56±1.23ABab ··· 0.26±0.02Aa ··· 0.28±0.12a ZLM 4.00±0.04BCb 5.92±2.44Aa 0.88±0.26Aa 0.24±0Aa ··· 0.37±0.19a 70 CK 4.19±0.07ABa 6.87±1.74ABa ··· 0.28±0.04Aa ··· 0.21±0.02a FA 4.21±0.03Aa 8.04±0.31Aa 0.65±0.14Aa 0.16±0ABa ··· 0.31±0.13a LP 3.99±0.03Cc 4.85±0.25Bb ··· 0.16±0.09ABa ··· 0.35±0.19a ZLM 4.08±0.03BCb 4.86±0.29Bb 0.38±0.13Bb … ··· 0.22±0.03a 变异来源2) 含水量 ** NS ** NS ··· NS 添加剂 ** NS ** ** ··· NS 含水量×添加剂 NS ** ** ** ··· NS 　1) 表中数据为平均值±标准误；同列数据后凡是具有一个相同小写字母或大写字母者，分别表示在0.05或0.01水平差异不显著(Duncan’s法)；···表示未检出；2) *和**分别表示0.05和0.01水平差异显著，NS表示差异不显著(双因素方差分析)

表 2 不同处理黄梁木叶青贮饲料的pH、有机酸含量和w(NH4+-N)/w(TN)1) Table 2 pH values, organic acid contents and ammonia nitrogen/total nitrogen ratios of Neolamarckia cadamba leaf silage in different treatments

由表3可知，含水量、添加剂及两者的交互作用对乳酸菌和酵母菌的数量均有极显著影响(P<0.01)。2种含水量条件下，3种添加剂处理的乳酸菌数量较CK降低，其中FA和ZLM处理组均达到极显著水平(P<0.01)。在80%含水量条件下，FA和LP处理的酵母菌数量较CK极显著和显著降低，ZLM处理的酵母菌数量较CK极显著增加。在70%含水量条件下，3种添加剂处理的乳酸菌数量(cfu·g^–1)的对数均低于3.00，均极显著低于CK，酵母菌和大肠埃希菌数量的对数均低于2.00，且前者也极显著低于CK。

表 3 Table 3

表 3 不同处理黄梁木叶青贮饲料的主要微生物类群数量1) Table 3 Major mircroorganism group quantities of Neolamarckia cadamba leaf silage in different treatments 含水量(w)/% 　　添加剂 lg(菌群数量) 乳酸菌 酵母菌 大肠埃希菌 80 CK 5.79±0.17Aa 2.88±0.17Bb <2.00 FA <2.00Bb <2.00Cd <2.00 LP 3.54±0.33Aa 2.59±0.16Bc <2.00 ZLM <2.00Bb 3.39±0.07Aa <2.00 70 CK 5.20±0.44Aa 3.34±0.34Aa <2.00 FA <3.00Bb <2.00Bb <2.00 LP <3.00Bb <2.00Bb <2.00 ZLM <3.00Bb <2.00Bb <2.00 变异来源2) 含水量 ** ** ··· 添加剂 ** ** ··· 含水量×添加剂 ** ** ··· 　1) 表中数据为平均值±标准误；同列数据后凡是具有一个相同小写字母或大写字母者，分别表示在0.05或0.01水平差异不显著(Duncan’s法)；2) *和**分别表示0.05和0.01水平差异显著，NS表示差异不显著(双因素方差分析)；···表示未检出

表 3 不同处理黄梁木叶青贮饲料的主要微生物类群数量1) Table 3 Major mircroorganism group quantities of Neolamarckia cadamba leaf silage in different treatments

含水量和添加剂对黄梁木叶青贮饲料化学成分的影响见表4。双因素方差分析表明，含水量对干物质、中性洗涤纤维、酸性洗涤木质素和酸性洗涤纤维的影响达到极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)水平；添加剂除对酸性洗涤木质素和可溶性碳水化合物含量分别有显著和极显著影响外，对其他指标均无显著影响(P>0.05)；两者的交互作用对干物质和可溶性碳水化合物含量影响极显著(P<0.01)，对其他指标无显著影响(P>0.05)。2种含水量条件下，FA处理的黄梁木叶可溶性碳水化合物含量显著或极显著高于CK及其他处理组。在80%含水量条件下，FA处理显著增加了半纤维素含量(P<0.05)，ZLM处理显著降低了干物质含量(P<0.05)。在70%含水量条件下，FA处理的干物质、粗蛋白和酸性洗涤木质素含量较CK显著降低(P<0.05)，其他指标无显著变化；LP和ZLM处理对所有化学指标无显著影响(P>0.05)。

表 4 Table 4

表 4 黄梁木叶青贮饲料的化学成分1) Table 4 The chemical composition of Neolamarckia cadamba leaf silage 含水量/% 　添加剂 干物质 粗蛋白 可溶性碳水化合物 中性洗涤纤维 80 CK 21.46±0.78Aa 21.81±0.62Aa 1.87±0.27Bb 28.79±1.65a FA 22.29±1.31Aa 20.12±0.80Aa 4.60±0.58Aa 31.21±1.80a LP 18.92±1.83Aab 20.50±1.95Aa 1.45±0.57Bb 28.31±1.46a ZLM 17.88±2.69Ab 19.09±2.65Aa 1.74±0.02Bb 28.95±1.87a 70 CK 30.80±2.23Aa 21.23±0.97Aa 3.44±0.41ABb 32.99±1.92a FA 25.37±3.88Ab 18.96±1.47Ab 5.15±1.22Aa 33.24±2.10a LP 29.91±0.07Aab 20.91±0.79Aa 2.10±0.43Bb 34.71±2.81a ZLM 32.03±2.94Aa 21.38±0.29Aa 2.26±0.35Bb 32.16±2.14a 变异来源2) 含水量 ** NS NS ** 添加剂 NS NS ** NS 含水量×添加剂 ** NS ** NS 含水量/% 　添加剂 酸性洗涤纤维 纤维素 半纤维素 酸性洗涤木质素 80 CK 22.43±2.35a 10.17±0.6Aa 6.36±0.89ABb 11.46±1.78Aa FA 22.67±1.97a 10.69±1.06Aa 8.54±0.44Aa 10.26±2.32Aa LP 21.31±1.39a 11.99±1.13Aa 7.00±0.34ABb 8.51±1.30Aa ZLM 22.88±1.95a 11.15±2.91Aa 6.08±1.14Bb 11.00±1.88Aa 70 CK 25.59±1.94a 8.27±0.58Aab 7.40±2.59Aa 16.31±2.41Aa FA 24.10±2.55a 12.92±2.93Aa 9.14±3.52Aa 9.71±1.37Ab LP 25.58±0.70a 10.21±1.46Aab 9.13±2.20Aa 16.50±4.48Aa ZLM 23.53±2.52a 7.24±2.94Ab 8.63±1.25Aa 17.10±3.21Aa 变异来源2) 含水量 * NS NS ** 添加剂 NS NS NS * 含水量×添加剂 NS NS NS NS 　1) 表中数据为平均值±标准误，除了干物质以外，均为占干物质的质量分数；同列数据后，凡是具有一个相同小写字母或大写字母者，分别表示在0.05或0.01水平上差异不显著(Duncan’s法)；2) *和**分别表示0.05和0.01水平差异显著，NS表示差异不显著(双因素方差分析)

表 4 黄梁木叶青贮饲料的化学成分1) Table 4 The chemical composition of Neolamarckia cadamba leaf silage

优质蛋白饲料需要有较高的粗蛋白含量和合适的纤维含量。Zayed等^[19]研究认为，与苜蓿Medicago sp. 和银合欢Leucaena leucocephala相比，黄梁木具有更高的饲料质量。本研究中黄梁木叶原料中的粗蛋白质量分数为22.89%，高于盛花期紫花苜蓿Medicago sativa(14%~15%)^[20]，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维质量分数分别为32.84%和24.91%，均低于热带木本饲用灌木中性(38.83%)、酸性(33.67%)洗涤纤维的平均含量^[21]。因此，黄梁木叶具有较高饲用价值。调制青贮优质饲料，要求原料有适宜的含水量，较低的缓冲能以及一定量的以可溶性碳水化合物形式存在的可供乳酸菌发酵的底物^[22]。研究表明，可溶性碳水化合物是影响青贮发酵品质的重要因素，只有充足的可溶性碳水化合物才能在发酵初期为乳酸菌提供足够的碳源，使其产生大量乳酸，迅速降低pH并抑制其他杂菌的生长。一般认为，可溶性碳水化合物的质量分数高于5%才能保证良好的发酵效果^[23]。本研究中，黄梁木叶的可溶性碳水化合物质量分数为4.76%，未达到优质青贮所需要的底物水平，但与苜蓿、红三叶Trifolium pretense相比其缓冲能较低，与玉米接近^[24]，为29.28 g·kg^–1，直接青贮，其pH可降到4.18，w(NH₃-N)/w(TN)仅为0.21%，且无丁酸产生，说明黄梁木叶可直接青贮。

原料含水量对青贮发酵过程有重要影响，过高的含水量不利于青贮，适当降低含水量可提高青贮发酵品质^[25-26]。本研究结果表明，原料含水量对黄梁木叶青贮品质有显著影响。随着含水量的降低，黄梁木叶青贮饲料的可溶性碳水化合物含量极显著增加，粗蛋白含量变化不大，这与关皓等^[27]、周娟娟等^[4]研究结果一致。成功的青贮要求pH达到4.2以下，这样才能为乳酸菌生长提供一个稳定的环境^[28]。本研究中，除70%含水量条件下FA处理的pH略高于4.2，其他添加剂处理的pH均小于4.2，pH随着含水量的降低而增加，差异达到极显著水平(P<0.01)，这与Haigh等^[29]的研究结果一致。有机酸含量随着含水量的降低变化不一^{[11, 25]}。本研究中，含水量对乳酸含量无显著影响，且乳酸含量明显高于乙酸、丙酸和丁酸，说明青贮发酵以乳酸发酵为主，同时随着含水量降低，乙酸含量极显著降低，这可能是因为适当降低含水量在一定程度上抑制了乙酸菌的活动。丁酸含量和w(NH₃-N)/w(TN)是衡量青贮饲料优劣的关键，一般认为优质青贮饲料的丁酸含量应低于1%，w(NH₃-N)/w(TN)应低于10%^[22]。本研究中，2种含水量下均未检测到丁酸，且w(NH₃-N)/w(TN)远低于10%，这可能是由于黄梁木叶本身缓冲能较低，在青贮初期，乳酸菌大量繁殖并迅速降低了青贮原料的pH，形成了一个良好的乳酸发酵条件，一定程度上抑制了其他好氧微生物的生长，减少了蛋白质的分解；另一方面，黄梁木叶富含单宁等多酚类物质^[30]，可与青贮饲料中的蛋白质结合形成络合物，减少青贮过程中蛋白质的分解^[31]。

青贮中选择合适的添加剂可为乳酸菌创造理想的发酵环境，减少养分损失，可显著改善青贮的发酵品质。乳酸菌剂作为发酵促进型添加剂添加到青贮饲料中后，可保证青贮初期发酵所需的乳酸菌数量，加快乳酸菌繁殖，产生大量乳酸，使pH迅速降低。本研究中，添加了LP和ZLM这2种乳酸菌剂后，黄梁木叶的pH极显著降低，其中LP处理的pH最低，这与Yuan等^[32]、Ando等^[33]的研究结果一致。但2种乳酸菌剂处理组均未能降低中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素含量，说明乳酸菌在降低纤维含量方面作用有限，原因可能是乳酸菌青贮处理缺少相关的纤维素降解酶，不能对木质素–纤维素–半纤维素复合结构产生实质影响，尽管ZLM添加剂中含有纤维素酶，但添加效果可能受到酶的添加量、原料成熟度等的影响^[16]。此外，2种含水量条件下添加2种乳酸菌剂后，乳酸菌的数量较CK均减少，这可能是添加的乳酸菌与黄梁木叶本身附着的乳酸菌存在相互竞争，相互抑制的缘故^[32]。在80%含水量条件下，LP处理的青贮饲料中酵母菌数量较CK显著减少，在70%含水量条件下，2种乳酸菌剂均能显著降低酵母菌数量，这表明2种添加剂均能在一定程度上抑制好氧微生物的生长繁殖，且LP添加效果更好。甲酸具有强烈的抗菌作用，在青贮饲料中被广泛应用。侯美玲等^[8]将甲酸添加到天然牧草的青贮中，发现加入甲酸的青贮饲料的乳酸含量和w(NH₃-N)/w(TN)显著下降，可溶性碳水化合物含量显著增加，王永新等^[34]在红三叶中添加甲酸后也得到相同结果。本研究中，在80%含水量条件下添加FA后，黄梁木叶的pH显著降低，70%含水量下pH较CK增加，但差异不显著，同时2个含水量条件下可溶性碳水化合物含量显著高于CK和其他处理，且未影响干物质、粗蛋白等成分，说明FA抑制了不良微生物的发酵以及植物呼吸活动对可溶性碳水化合物的损耗，在一定程度上改善了黄梁木叶的青贮发酵品质。