2018, Vol. 39
2. 扬州大学 园艺与植物保护学院，江苏 扬州 225009
2. College of Horticulture and Plant Protection, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
芍药Paeonia lactiflora属于芍药科Paeoniaceae芍药属Paeonia，具有观赏价值，但其颜色主要为红色系和白色系，黄色系等品种非常稀少，一定程度上限制了其产业发展。目前对芍药花色的改良主要集中在生理、生化水平或通过杂交选育获得新奇花色，而对芍药花色形成的分子机制研究较少，利用基因工程手段进行花色定向选育的研究更为少见[1]。相关研究报道表明植物类黄酮合成途径中许多关键酶编码基因与花色调控密切相关[1-3]。扬州大学观赏园艺课题组前期对嵌合体芍药品种‘金辉’内外瓣进行转录组测序，结果发现在芍药类黄酮途径中黄酮醇合酶基因(PlFLS)等在黄色内瓣中较红色外瓣出现低表达，揭示PlFLS基因等可能对芍药花色形成起到重要的调控作用[1]。
作为类黄酮合成途径和儿茶素合成途径连接的中间桥梁，黄酮醇合酶对植物花色呈色起重要调控作用[4]。同时黄酮醇合酶(Flavonol synthase，FLS)基因在植物中的保守度很高，目前研究人员已成功从矮牵牛、烟草等多个物种中克隆得到了FLS基因[5-6]。FLS能够催化植物类黄酮生物合成途径中黄酮的C3位，使其发生羟基化，最终形成不同种类的黄酮醇类化合物。黄酮醇主要存在杨梅素、槲皮素和山奈酚3种结构形式，分别由FLS催化二氢杨梅素、二氢槲皮素和二氢山奈酚形成[7]。研究发现，利用基因沉默技术抑制洋桔梗FLS的表达，可使花的颜色由紫色转变成红色，并能在后代植株中稳定遗传该性状[8]。在大豆相关研究中发现，FLS基因突变能改变其花瓣颜色，表现为单一碱基缺失导致花色从粉色变为洋红色[9]。此外，在矮牵牛体内抑制FLS基因的表达可使紫色花瓣变成黑紫色，而表达正义月季的FLS基因，使紫色的花瓣变成了浅紫色[10]。
以上研究表明FLS基因在植物花色调控中的关键作用，但当前对于FLS基因在芍药花色形成中潜在的调控机制尚不清楚。作为观赏价值极高的花卉植物，如能够通过分子生物技术对其花色进行调控，打破种内花色基因库的有限性，培育出种内空缺的新色系，则具有潜在市场价值。为此，本研究构建芍药PlFLS基因表达载体，通过遗传转化模式植物拟南芥，并对其性状进行初步分析，为进一步揭示基因的生物学功能奠定基础，为利用PlFLS基因进行芍药花色分子育种提供资料参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料选用扬州大学芍药种质资源圃(32°23′N，119°24′E)种植的红色芍药栽培品种‘红艳争辉’为试验材料，5月采集盛花期的花瓣后立即置于液氮中速冻，–80 ℃超低温冰箱中保存备用。经春化的野生型拟南芥Col-0均匀点播在1/2 MS培养基上，7 d后移栽至营养土、蛭石、珍珠岩(体积比为2∶1∶1)的混合物基质中，在人工气候培养箱(SANYO，MLR-359H，日本)中以光照8 h(22 ℃)、黑暗16 h (18 ℃) 进行短日照培养，相对湿度控制在70%~80%。
1.2 目的基因克隆称取适量芍药花瓣样品在液氮中研磨均匀后按照TaKaRa Mini BEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒(TaKaRa, Japan)说明书提取总RNA，经超微量紫外分光光度计(Nanodrop100，美国)测定质量合格后(D260 nm/D280 nm约为2.0)，立即用PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA eraser反转录试剂盒(TaKaRa, Japan)合成cDNA的第1条链。参照GenBank收录的芍药PlFLS基因全长序列(KM259902.3)，通过Primer 6.0软件设计1对特异性引物进行扩增(F：5'-TTTCAAAAAATGGAGGTGGTGGAGA-3'，R：5'-ACCTTGGTGGTATAACAATGAGAAA-3')。所用反应条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，进行30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经10 g·L–1的琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化目的片段连接至pEASYTM-T5载体，转化并提取质粒PlFLS-T5后送交上海生工生物科技有限公司测序。
1.3 生物信息学分析克隆产物经测序获得芍药PlFLS基因cDNA序列后，与从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)在线选取金花茶等植物FLS基因氨基酸序列，利用DNAMAN5.2.2软件对不同物种间同源序列进行比对。同时通过MEGA6[11]软件以Neighbor-joining法分析构建系统进化树[12]，经过1 000次Bootstrap校验。通过ProtParam软件(http://web.expasy.org/protparam/)分析PlFLS蛋白理化性质[13]。利用SMART网络数据库(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析PlFLS蛋白功能结构域[14]。利用SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对其信号肽进行预测[15]。通过SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)构建芍药PlFLS蛋白的三级结构，预测其潜在补体位置及功能[16]。
1.4 过表达载体构建及验证根据获得的PlFLS基因cDNA序列，结合双元表达载体pCAMBIA1301上的限制性酶切位点，设计带有BamH I酶切位点的上游引物PlFLS-F1: 5′-CGC GGATCCATGGAGGTGGTGGAGA-3′和带有Kpn I酶切位点的下游引物PlFLS-R1:5′-CGG GGTACCTTATTGTGGGAGCTTGTT-3′(带有下划线的序列为酶切位点)，以PlFLS-T5质粒为模板，扩增PlFLS基因完整的ORF。将目的片段与表达载体pCAMBIA1301分别进行双酶切，回收酶切产物后用T4 DNA连接酶15 ℃连接，转化大肠埃希菌感受态细胞，过夜培养后挑取单克隆菌落，用PlFLS-F1和PlFLS-R1进行菌液PCR鉴定阳性克隆，提取重组质粒，酶切鉴定并送上海生工生物科技有限公司测序，阳性重组子命名为pB1301-PlFLS。
1.5 拟南芥遗传转化采用冻融法将重组质粒与空载质粒分别转化农杆菌EHA105，挑选经验证的阳性重组农杆菌单菌落，保存。待拟南芥盛花期，活化保存菌液，接种于含50 mg·L–1利福平和50 mg·L–1卡那霉素的YEB培养基中，28 ℃，200 r·min–1培养16 h以上，至其D600 nm约为0.7~0.8，离心收集菌体，用转化液(1/2 MS培养基，50 g·L–1蔗糖，200 μL·L–1 Silwet L-77表面活性剂)剧烈悬浮沉淀至起始体积，装入烧杯中作为侵染液。然后采用改良的Floral-dip法将拟南芥花蕾在侵染液中浸泡1 min，保鲜膜保湿暗培养12 h以上后正常培养。为提高转化率，7 d后再次按上述方法侵染1次，然后置于人工气候培养箱培养。待种子成熟后，收取种子，记为T0代。
1.6 转基因拟南芥的筛选与鉴定T0代种子晾干且经过4 ℃低温春化、消毒后，均匀播种于潮霉素(25 mg·L–1)抗性平板上初步筛选T1代。2周后将能长出真叶和根的阳性苗移栽到基质中，做好标记。当幼苗长至10片左右莲座叶时，每株剪取3片小叶进行GUS染色，进一步对阳性植株进行验证，排除假阳性的现象。单株收获阳性T1代转基因植株，标成不同株系，收获的种子记为T1代。随后继续播种筛选，单株收获的T1代种子已经出现性状分离。筛选抗性分离比接近3∶1的株系继续种植于基质中，随机选择幼苗进行GUS染色鉴定，待种子成熟后单株收种，记为T2代。用少量T2代种子经潮霉素筛选，直到筛选后全部为抗性苗，即得到纯合的T3代转基因株系，做好标记并大量繁殖。
取抽薹期的初步鉴定的纯合转基因阳性拟南芥和野生型拟南芥叶片，提取gDNA进行gus基因和目的基因的PCR检测，引物包括gus-F：5′-TCTCCCGCTATGTATGTCGC-3′，gus-R：5′-TAAGGTCACGTCCAGCAAGG-3′，PlFLS-F2：5′-GCTATCTCATCCGCACAA-3′，PlFLS-R2：5′-CCAGGCTTTACACTTTATGC-3′。
同时对纯合转基因拟南芥和野生型拟南芥叶片提取总RNA，反转录为cDNA备用(方法同“1.2”)。以Actin2(AK230311.1)为内参基因，获得的cDNA为模板，设计基因特异性引物PlFLS-F3：5′-GCTATCTCATCCGCACAA-3′和PlFLS-R3：5′-CTTCAAACTTTCCTCTACCAG-3′，通过Bio-Rad公司Real-Time System (CFX96) 进行实时定量PCR(qRT-PCR)，检测PlFLS基因的相对表达量，参照SYBR®Premix Ex TaqTM说明书进行，基因的相对表达水平采用2–△△Ct法进行计算[17]。
1.7 高效液相色谱测定采集纯合转基因拟南芥和野生型拟南芥植株叶片，称取0.1 g经液氮研磨，溶于1 mL提取液(甲醇、HCl、双蒸水体积比为70.0∶0.1∶29.9)，置于4 ℃下24 h。将提取液通过0.22 μm有机相微孔滤膜过滤，供色素的定量分析使用。利用扬州大学测试中心Agilent-2100高效液相色谱系统，选择Asibut C18 TSK gel ODS-80Ts QA色谱柱(4.6 mm×150 mm，Tosoh Co. Ltd.，日本)，设置色谱条件：流动相：无水乙腈、体积分数为0.5%的甲酸；洗脱梯度：甲酸的体积分数(时间)为5% (0 min)，10% (30 min)，15% (50 min)，20%(60 min)，25% (65 min)，5% (75 min)，5% (90 min)。流速为0.8 mL·min–1，柱温保持35 ℃，进样量为5 μL，进行花黄素(350 nm)检测[18]。花瓣中类黄酮含量采用标准品半定量法，以μg·g–1新鲜花瓣计，以芦丁作为标准样品根据峰面积计算花黄素类物质的含量。
1.8 数据分析试验数据通过SPSS 20.0(IBM，美国)进行分析。选择有重复测量值的一般线性模型进行单因素方差分析，并通过Duncan’s检验进行多重比较。
2 结果与分析 2.1 芍药PlFLS基因克隆及生物信息学分析以芍药品种‘红艳争辉’花瓣RNA反转录的cDNA第1条链为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果表明，PCR产物大小约1 100 bp，长度大小与预期目标相符。测序结果显示，成功克隆获得PlFLS基因，目的基因全长1 073 bp，含起始密码子、终止密码子，包含999 bp的完整开放阅读框(ORF)，编码332个氨基酸，与NCBI公布序列一致，可用于下一步试验。用ProtParam对其编码的蛋白理化特性进行分析表明，其分子式为C1708H2646N452O496S12，含有5 314个原子，相对分子质量为37 830，理论等电点pI为5.68，含亮氨酸最多(质量分数为10.2%)，据此划分为不稳定性蛋白。通过将芍药与其他22种植物的FLS基因进行氨基酸水平上的比对，发现芍药与茶树Camellia sinensis(DQ198089.1)、葡萄Vitis vinifera (AB213566.1)、山甜菜Nekemias grossedentata(KC753782.1)、苦荞麦Fagopyrum tataricum(JX401285.1)和洋葱Allium cepa(KY369210.1)的序列相似性分别达77%、78%、76%、65%和52%。利用MEGA6对其构建系统进化树，如图1所示，芍药PlFLS基因编码的蛋白最先与茶树聚为一类，在遗传进化上关系最近(置信度79%)，与葡萄、山甜茶亲缘关系相对较近，而与银杏的亲缘关系相对较远。
SMART预测发现PlFLS蛋白存在2个明显的功能结构域，其中结构域DIOX_N位于第41~148位氨基酸，结构域2OG-Fell_Oxy位于第193~293位氨基酸。进一步对其信号肽进行了预测。信号肽是引导蛋白肽链进入内质网加工的一段疏水性区域，对蛋白的生物合成起重要作用。选用SignalP4.1网络数据库对PlFLS编码蛋白进行预测，并未发现其具有潜在信号肽位点，为非分泌性蛋白。
PlFLS基因编码蛋白的三级结构通过SWISS-MODEL进行了预测(图2A)，结果显示该蛋白含α螺旋32.5%，延伸链18.98%，无规则卷曲48.49%，存在1个2–氧代戊二酸配体，该配体与PlFLS蛋白中多条氨基酸肽链相连接，揭示其可能具有重要生物学作用(图2B)。
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图 1 基于FLS基因的系统进化树 Figure 1 Phylogenetic tree based on FLS gene |
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图 2 PlFLS蛋白三级结构预测 Figure 2 The tertiary structure prediction of PlFLS protein |
构建由2×CaMV35S启动子驱动的含有正向PlFLS编码区的过表达载体pB1301-PlFLS，为了确保重组克隆的正确性，排除假阳性现象，将转化后平板上筛选得到的单克隆进行菌液PCR验证，可获得一条1 000 bp左右的片段(图3A)，长度与PlFLS基因编码区片段大小一致，PCR验证结果为阳性。对阳性克隆的菌液提取质粒DNA，并对重组质粒进行BamH I-Kpn I双酶切，结果如图3B所示，均酶切得到了1 000 bp左右的目的基因条带和10 000 bp左右的载体片段，与预期结果一致。并将阳性克隆送测序公司测序，测序分析PlFLS基因正向插入到2×CaMV35S启动子下游，且编码区没有发生碱基突变，证明pB1301-PlFLS过表达载体构建成功，其结构见图3C。
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图 3 pB1301-PlFLS超表达载体验证及结构 Figure 3 Identification and structure of over-expression vector pB1301-PlFLS A：pB1301-PlFLS PCR；B：质粒PCR；C：载体结构示意图；M1：DL 2 000 Marker，M2：DL 15 000 Marker，1~5：PCR结果，6~10：双酶切结果 |
利用改良的Floral-dip法遗传转化野生型拟南芥，转化成功的T0代种子在含有潮霉素(25 mg·L–1)的MS平板上缓慢生长，未转化的虽能发芽但长出2片子叶后逐渐黄化或死亡。挑选生长正常的幼苗进行移栽培养，经GUS叶片组织染色出现蓝色，排除假阳性现象。单株收取各株系T1代种子，均对潮霉素的抗性产生分离，选取分离比例接近3∶1的T2代拟南芥株系单株收种。随机对生长15~20 d的T2代拟南芥幼苗进行GUS组织化学染色分析，野生型拟南芥未携带gus基因，整个植株呈无色；转化空载体和携带PlFLS的转基因拟南芥，gus基因在全株表达，呈蓝色(图4A)，间接说明目的基因已被整合到拟南芥基因组上。最终获得纯合转PlFLS基因拟南芥株系3个，分别标记为Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ号，用于后续试验。
抽薹期提取T3代拟南芥DNA进行PCR鉴定，由电泳胶图可以看出，对目的基因进行扩增时，转PlFLS纯合拟南芥均扩增出约1 236 bp的条带，与重组质粒的PCR结果相同，而转空载纯合拟南芥及野生型拟南芥均无扩增出条带(图4B)，初步分析PlFLS基因已整合到拟南芥的基因组DNA中。如图4C所示，在进行gus基因检测时，3株转基因拟南芥扩增出与转空载对照大小一致的特异性条带，进一步说明重组植物过表达载体成功转化拟南芥。
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图 4 转PlFLS基因拟南芥的筛选及纯合株系的获得 Figure 4 Screening of transgenic Arabidopsis and obtaining of homozygous PlFLS lines A：GUS染色；B：目的基因PCR检测；C：gus基因PCR检测；M：DL 2 000 Marker，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ为转PlFLS基因拟南芥，CK+：以重组质粒为阳性对照，WT：野生型拟南芥，CK–：以无菌水为阴性对照 |
在内参调平的情况下，提取T3代和野生型拟南芥总RNA，通过实时荧光定量PCR进一步检测PlFLS在转基因株系中的转录表达情况(图5)。结果表明目的基因在转空载拟南芥(pB1301)及野生型拟南芥中均几乎无表达，3个转基因株系中PlFLS基因表达量均显著高于对照组拟南芥。其中，Ⅱ号和Ⅲ号PlFLS表达量较高，显著高于Ⅰ号株系，但Ⅱ号和Ⅲ号之间则差异不显著，选用于后续试验。
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图 5 拟南芥植株PlFLS 基因实时定量PCR分析 Figure 5 qRT-PCR analysis of PlFLS gene in Arabidopsis plants Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ为转PlFLS基因拟南芥；柱子上凡是有一个相同小写字母者，表示差异不显著(P>0.05, Duncan’s 法) |
对T3代转基因拟南芥肉眼观察结果显示(图6)，各植株与对照组拟南芥相比，花器官、花色没有发生可见变化，除茎干长度、莲座叶数外，叶色、叶片大小、花期等生物学特性未见显著差异。进一步通过高效液相色谱法分析转基因高表达株系Ⅱ号和Ⅲ号叶片的花黄素含量(图7)。根据计算图7的峰面积，PlFLS基因2个过表达株系的叶片花黄素平均质量分数分别为653.55和642.66 μg·g –1(以鲜质量计)，均显著高于野生型对照。
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图 6 转基因拟南芥表型 Figure 6 Phenotypes of transgenic Arabidopsis lines |
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图 7 转基因拟南芥叶片花黄素含量液相色谱图 Figure 7 HPLC chromatograms of anthoxanthin contents in transgenic Arabidopsis leaves |
芍药作为重要的观赏植物，花色是其商业价值的一个重要体现。目前，类黄酮合成路径相关基因在芍药花色形成过程中的调控机制研究鲜见报道，Zhao等[1]前期研究筛选到芍药PlFLS基因为该途径中调控芍药花色的关键基因之一。为进一步探究其生物学功能，本研究克隆芍药PlFLS基因并对其进行了序列分析，结果表明芍药PlFLS基因全长为1 073 bp，包含1个编码332个氨基酸的完整开放阅读框(999 bp)。其编码蛋白含有5 314个原子，理论等电点pI为5.68，含亮氨酸最多(10.2%)，为非稳定性蛋白。构建系统进化树发现芍药PlFLS基因与茶树同源性最高，该基因编码蛋白存在2个功能结构域，但无潜在信号肽位点。此外，其蛋白三级结构中存在1个2–氧代戊二酸配体，该配体与蛋白中多条氨基酸肽链相连接，揭示其可能具有靶定位点等生物学作用。
与此同时，本研究还利用农杆菌介导法进行芍药PlFLS基因遗传转化拟南芥研究。农杆菌介导法为当前植物转基因主要方法之一，该方法技术成熟、操作简单、遗传稳定[19]，在多种植物中如石斛兰[20]、向日葵[21]等均得以成功应用。另外，王玹瑛[22]和丁忠涛[23]的研究表明在拟南芥转化试验中使用体积分数为0.2%~0.5%的Silweet L-77可以显著提高转化率。为此，本试验在参考花序浸染法的同时向转化液中添加了200 μL·L–1的Silweet L-77作为表面活性剂，使转化过程更彻底，并在盛花期前后侵染2次，以提高其转化效率。最后经GUS染色、基因组PCR、荧光定量等检测手段鉴定，证明芍药PlFLS基因已成功转化拟南芥植株的基因组，最终获得高PlFLS基因表达的纯合拟南芥株系3个。
FLS基因在花色调控中的作用研究发现，其是催化生成淡黄色或近无色黄酮醇支路的关键酶，在类黄酮途径中发挥着重要作用[24-27]。当前研究表明，光照、组织特性等都会影响FLS基因的表达[28-29]。黄伟伟[30]研究发现拟南芥中FLS基因表达受到白光诱导，其研究还发现FLS基因在番茄果实着色过程中，果皮的表达量比较高，而在果肉中表达量却很低[30]。除此以外，分子手段研究FLS基因对花色调控中发现对矮牵牛和烟草分别引入正义外源FLS基因时，其花色均明显变浅[10, 31]。本试验中转芍药PlFLS基因拟南芥的目的基因表达量显著高于对照组，但花器官未见明显颜色改变，叶片均呈现鲜绿色。可能原因是本试验所选用拟南芥品种开白色花的哥伦比型拟南芥，不易察觉花瓣颜色变浅，从而未见明显颜色差异。
罗平[32]在对玫瑰、矮牵牛、桃的FLS基因进行功能验证时发现，转基因烟草黄酮醇含量增加，花色苷合成被限制，导致花色均由红色变为白色。相反地，Mahajan等[33]沉默烟草的FLS基因后研究黄酮醇合成量变化情况发现，转基因后黄酮醇的产量降低了20%~50%，儿茶素和表儿茶素的产量分别增加了50%~90%和20%~30%。此外，Luo等[31]研究转正义FLS基因烟草发现与对照组相比，烟草黄酮醇含量显著高出对照组30%~70%，花色苷的合成减少。以上报道表明FLS基因低表达或者高表达会显著影响类黄酮途径的产物，从而影响花色。为探究本试验中高PlFLS基因表达是否影响拟南芥类黄酮途径代谢产物，通过液相色谱法检测转基因拟南芥植株叶片花黄素含量，发现高PlFLS基因表达株系的花黄素含量均显著高于野生型拟南芥，推测PlFLS基因可能影响到拟南芥类黄酮合成途径，促进了黄酮醇类等花黄素的合成。但由于本试验所用拟南芥为白花系，花序小，观察不到明显颜色变化，下一步对该基因花色调控机制的研究仍需要借助深色系模式植物进行，进一步证实其在类黄酮途径中的重要地位。
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