2018, Vol. 39
狂犬病是一种重大的人畜共患病，它是由弹状病毒科Rhabdoviridae狂犬病病毒属Lyssavirus的狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)引起。RABV基因组编码5种结构蛋白质，分别是核蛋白(N蛋白)、磷蛋白(P蛋白)、基质蛋白(M蛋白)、跨膜糖蛋白(G蛋白)和病毒聚合酶蛋白(L蛋白)。病毒基因组RNA与核蛋白、磷蛋白和聚合酶蛋白缠绕组成核糖核蛋白(RNP)，成为RABV的复制单位[1-2]。M蛋白在病毒装配和出芽过程中发挥重要作用，其在G蛋白的辅助作用下介导病毒粒子和细胞的分离，从而顺利出芽[3-4]。G蛋白是唯一刺激机体产生中和抗体的表面抗原，同时也能诱导T细胞，刺激机体产生细胞免疫，不仅能在中枢神经系统(CNS)中清除病毒，也能诱导神经细胞发生凋亡[5-7]。研究表明，RABV感染后发生的细胞凋亡主要由G蛋白引起，且病毒的毒力越弱诱导的凋亡越严重[8-10]。
前期的研究发现，携带双G基因的重组RABV Hep-dG感染神经母细胞瘤(Neuroblastoma, NA)细胞后病毒滴度明显低于亲代毒株rHep-Flury[11]，而在BHK-21细胞中没有相同现象[8]。蛋白质组研究发现，Hep-dG感染NA细胞后诱发干扰素通路上游和下游蛋白的大量上调，生物信息学预测结合Western-blot和荧光定量PCR证明干扰素通路仅在Hep-dG感染组强烈激活，表明RABV弱毒病毒G蛋白的过表达与干扰素的诱导呈高度的正相关[11]，由于BHK-21是RIG-I介导IFN通路的缺陷型细胞[12]，推测2株重组RABV在BHK-21细胞和NA细胞中的病毒滴度可能与干扰素通路的激活有关。在此基础之上，本研究进一步研究重组RABV感染NA细胞诱导产生干扰素的原因，以揭示G蛋白与干扰素诱导之间的内在关系；并通过抗体阻断试验，证明干扰素诱导在RABV复制中的作用。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞和病毒鼠NA细胞，购自武汉生物制品研究所，在含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640中培养；亲代RABV rHep-Flury和携带双G基因的重组RABV Hep-dG[8]，保存于华南农业大学兽医微生物实验室。
1.1.2 质粒pH-G(含有狂犬病病毒Hep-Flury株的G基因)，由日本国立传染病研究所Dr. Morimoto教授惠赠。pH-M和pH-GFP，均由华南农业大学兽医微生物实验室罗永文博士在pcDNA3.2插入了Hep-Flury的M基因和GFP基因而构建。
1.1.3 主要试剂STAT1、p-STAT1和β-actin单克隆抗体，HRP标记的山羊抗鼠IgG、HRP标记的山羊抗兔IgG和绿色荧光Dylight 488标记的山羊抗鼠IgG，均为美国Bioworld公司产品。小鼠抗IFN-β中和抗体和正常鼠源IgG阴性对照，购自美国R&D公司。Clontech Xfect质粒转染试剂购自日本TaKaRa公司。荧光定量PCR试剂盒(THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix)购自日本东洋纺公司。抗RABV G蛋白和M蛋白单克隆抗体由华南农业大学兽医微生物实验室制备。
1.2 方法 1.2.1 荧光定量PCR检测IFN-β mRNA的表达将rHep-Flury和Hep-dG以相同的感染复数(MOI=0.01)感染6孔板中的NA细胞，同时设未接毒的细胞为空白对照。在接毒后12、24、36和48 h，用1 mL 4 ℃预冷的PBS(pH7.4，0.01 mol·L–1)洗涤细胞1次，再加入1 mL Trizol，抽提RNA，定量检测不同时间IFN-β mRNA的表达。
1.2.2 Western-blot检测STAT1和p-STAT1的表达将rHep-Flury和Hep-dG以相同的感染复数(MOI=0.01)感染6孔板中的NA细胞，同时设未接毒的细胞作为空白对照。在接毒后24和48 h，分别提取细胞蛋白，进行STAT1和p-STAT1的蛋白定量和Western-blot检测。
1.2.3 重组病毒吸附细胞能力的检测将rHep-Flury和Hep-dG分别以MOI为0.01、0.10和1.00接种6孔板中的NA细胞，同时设未接毒的细胞作为空白对照。细胞在4 ℃冰箱内放置2 h后，PBS洗去未结合的病毒粒子，然后提取细胞RNA，以特异引物vRNA-F和vRNA-R(表1)进行荧光定量PCR(同时以GAPDH-F和GAPDH-R为参照)检测细胞表面病毒的基因组vRNA，由此可检测不同重组RABV的吸附能力[13]。
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表 1 荧光定量PCR检测引物 Table 1 Primers used for fluorescence quantitative PCR detection |
将rHep-Flury和Hep-dG分别以MOI为0.01、0.10和1.00接种6孔板中的NA细胞，同时设未接毒的细胞为空白对照。细胞在4 ℃冰箱内放置2 h后，PBS洗去未结合的病毒粒子，继续在37 ℃细胞培养箱放置2 h。用质量分数为0.25%不含EDTA的胰酶处理病毒吸附的细胞膜，去掉细胞膜表面RABV，然后提取细胞RNA，用荧光定量PCR检测内部残余的病毒基因组vRNA，即为入侵细胞的病毒量。
1.2.5 重组病毒Leader RNA、vRNA和RIG-I转录水平的检测将rHep-Flury和Hep-dG以MOI=0.01接种12孔板中的NA细胞，同时设未接毒的NA细胞作为空白对照。分别在感染后12、24、36和48 h取出细胞，弃培养液。用PBS洗涤细胞1次，每孔加入500 μL Trizol裂解液，抽提样品RNA。以5'-CCAGATGCTTGGCGTCCTCTTTGCAACTGACGATGT-3'和5'-GGAAAAGGGACATTTGAAAGAA-3'为反转录引物，分别合成RABV Leader RNA和vRNA的cDNA。RIG-I的反转录不需要特异性的反转引物，使用ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover逆转录反应试剂盒进行反转录。以表1的特异引物将获得的cDNA进行荧光定量PCR检测，同时GAPDH作为内参引物。
1.2.6 重组病毒Leader RNA的二级结构分析通过RNA fold Web SeVer在线软件分析2株重组RABV Leader RNA的二级结构。
1.2.7 pH-G与pH-M质粒在NA细胞上的表达将5 μg质粒DNA用转染缓冲液稀释至最终体积为100 μL，添加1.5 μL Xfect Polymer，在涡旋混匀器中混匀10 s。室温孵育10 min后，加入到细胞汇合度为50%~70%、37 ℃培养了12~16 h的NA细胞中。37 ℃继续培养4 h后，更换培养液后，放入37 ℃细胞培养箱，分别在24、48和72 h后取出，加入抗G和M蛋白抗体，进行间接免疫荧光检测。
1.2.8 IFN-β的转录水平和抗体阻断试验将pH-G与pH-M质粒DNA按上述方法转染NA细胞，在合适的时间点取出，提取RNA，荧光定量PCR检测真核表达G、M蛋白后IFN-β的转录水平。
将NA细胞铺于6孔板中，37 ℃培养12~16 h。待细胞汇合度为80%，弃培养液，在各孔中加入2 mL无血清的DMEM和Anti-IFN-β(10 mg·L–1)，预处理细胞1 h。将rHep-Flury和Hep-dG以MOI=0.01接种NA细胞，在37 ℃吸附1 h，同时设未接毒的NA细胞作为空白对照。更换含有Anti-IFN-β的新鲜培养基。在接毒后48 h，收集上清液，检测RABV的病毒滴度。同时，提取细胞RNA，用荧光定量PCR检测IFN-β的阻断情况[14]。
2 结果与分析 2.1 重组病毒感染NA细胞对IFN-β通路的影响为了确定重组RABV感染对NA细胞产生IFN-β的影响，在接毒后12、24、36和48 h，通过荧光定量PCR分别对rHep-Flury和Hep-dG感染细胞和空白对照细胞IFN-β的转录水平进行了分析，结果如图1a所示。在较低的感染复数(MOI=0.01)下，Hep-dG感染后24 h即可显著促进IFN-β基因的表达，36 h达到最高水平(P<0.001)。同时，Hep-dG感染24和48 h均可激活STAT1的磷酸化，Hep-dG感染组的STAT1的表达水平较亲代毒株rHep-Flury明显提高(图1b)。由此说明，在NA细胞中，Hep-dG感染能显著上调IFN-β mRNA的表达和激活干扰素下游因子STAT1。
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图 1 Hep-dG感染NA细胞激活IFN-β信号通路 Fig. 1 Hep-dG infection activated the IFN-β signaling pathway in NA cells a: Hep-dG感染增强IFN-β基因的表达水平，图中“*”、“**”和“***”分别表示直线两端所对应的样本差异达0.05、0.01和0.001的显著水平(t检验)；b:Hep-dG感染刺激STAT1的表达和激活，1：空白对照，2：rHep-Flury，3：Hep-dG |
为了比较G蛋白过表达的Hep-dG株与亲代毒株rHep-Flury对NA细胞的吸附能力，我们模拟了病毒吸附NA细胞的过程，并用荧光定量PCR检测了细胞表面病毒。结果(图2a)表明，Hep-dG在不同感染复数下对NA细胞的吸附能力均高于rHep-Flury。在很低的感染复数(MOI=0.01)下，Hep-dG对NA细胞的吸附能力也明显高于rHep-Flury(P<0.01)。为了比较G蛋白过表达的Hep-dG与rHep-Flury对NA细胞的入侵能力，我们模拟了病毒进入NA细胞的过程，并用荧光定量PCR检测了入侵细胞的病毒量。结果(图2b)表明，在较高感染复数(MOI=1.00)下，Hep-dG进入NA细胞的能力显著高于rHep-Flury(P<0.01)；而在很低的感染复数(MOI=0.01)下，Hep-dG进入NA细胞的能力与rHep-Flury无显著性差异。表明在较高的感染复数下，G蛋白的过表达显著提高了RABV对神经细胞的吸附与入侵能力。
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图 2 狂犬病病毒吸附和入侵NA细胞的分析 Fig. 2 Analyses of RABVs adsorbing and invading NA cells under different infection multiplicities a：细胞表面吸附狂犬病病毒的分析；b：狂犬病病毒入侵NA细胞的分析，各图中“*”和“**”分别表示直线两端所对应的样本差异达0.05和0.01的显著水平(t检验) |
为了研究重组RABV在细胞内Leader RNA的表达差异，将Hep-dG与rHep-Flury以相同的感染复数(MOI=0.01)感染NA细胞，利用荧光定量PCR检测了不同时间点细胞内Leader RNA的含量，同时检测了病毒基因组vRNA和RIG-I基因的转录水平，结果见图3。图3a显示，在感染后的不同时间点，Hep-dG Leader RNA在NA细胞中的含量明显高于亲代毒株rHep-Flury，其趋势与IFN-β基因的表达(图1a)一致。Hep-dG Leader RNA的表达量在接毒后36 h达到最高水平，48 h有所下降，但仍然显著高于亲代毒株rHep-Flury(P<0.01)。在感染36 h前，细胞内Leader RNA与病毒基因组vRNA的含量趋势一致；在感染36 h后，Leader RNA的表达水平开始下降，而NA细胞内vRNA的含量继续升高(图3b)。同时，RABV感染后，细胞内RIG-I基因的变化趋势与Leader RNA一致；在接毒后36和48 h，Hep-dG感染的NA细胞中RIG-I基因的表达量显著高于亲代毒株rHep-Flury(图3c, P<0.001)。表明Hep-dG感染NA细胞后，病毒的Leader RNA和vRNA升高，诱导RIG-I mRNA增多，导致了IFN-β mRNA增多。
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图 3 狂犬病病毒感染对Leader RNA、vRNA和RIG-I基因表达的影响 Fig. 3 Effects of rabies virus infections on expressions of Leader RNA，vRNA and RIG-Igene a：Leader RNA的表达，b：vRNA的表达，c：RIG-I基因的表达；各图中“**”和“***”分别表示直线两端所对应的样本差异达0.01和0.001的显著水平(t检验) |
基于自由能最小的预测算法，通过在线软件RNAfold Web Sever分析重组病毒Leader RNA的二级结构。箭头所示为RNA的5＇端，颜色越偏向红色，代表对应处碱基处于配对的概率越大；颜色越偏向紫色，代表对应处碱基处于配对的概率越小，结果如图4所示。由图4可见，rHep-Flury与Hep-dG具有完全相同的Leader RNA序列和二级结构，其最小自由能为–13.02 kJ·mol-1。说明2株RABV毒株的Leader RNA在结构上没有差异，IFN-β表达量的增加是由于Leader RNA的转录水平提高而引起。
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图 4 基于最小自由能的狂犬病病毒rHep-Flury和Hep-dG Leader RNA的二级结构 Fig. 4 The secondary structure of rabies viruses rHep-Flury and Hep-dG Leader RNA based on the minimum free energy |
为了研究G蛋白和M蛋白本身的过表达对IFN-β转录的影响，首先摸索pH-G和pH-M质粒转染细胞后表达的最佳时间点。分别将5.0 μg的pH-G和pH-M重组表达质粒转染NA细胞，转染相同质量的pH-GFP质粒作为阳性对照，设空白细胞作为阴性对照。结果显示，在转染后24、48和72 h，pH-G、pH-M和pH-GFP质粒在NA细胞上均有效表达，48 h的荧光强度最大(图5a)。依据试验摸索的最佳时间，将pH-G和pH-M质粒以5.0和2.5 μg分别转染NA细胞，设空白细胞为阴性对照、空载体转染的细胞为阳性对照，在转染后48 h，提取细胞RNA，用荧光定量PCR检测IFN-β的转录水平。结果显示，与空白细胞比较，5 μg的pH-G质粒转染能刺激IFN-β的转录(P<0.05)；而转染pH-M质粒均不能刺激IFN-β的转录(图5b)。说明G蛋白真核表达能在一定程度上刺激IFN-β的转录，这种刺激不依赖于RIG-I的识别，可能对Hep-dG激活干扰素通路起到一定的作用。
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图 5 G蛋白的真核表达对NA细胞中IFN-β转录的影响 Fig. 5 Effect of G protein eukaryotic expression on IFN-β transcription in NA cell a：pH-G、pH-M和pH-GFP的荧光表达；b：IFN-β基因的表达，CK：阴性对照，1：5.0 μg的pH-G，2：2.5 μg的pH-G，3：5.0 μg的pH-M，4：2.5 μg的pH-M，5：阳性对照，图中“*”表示直线两端所对应的样本达0.05的显著水平(t检验) |
为了明确IFN-β对重组狂犬病毒复制的影响，我们用IFN-β特异性中和抗体(质量浓度为10 mg·L–1)处理NA细胞以阻断IFN信号通路，同时将正常鼠源IgG阴性血清处理的细胞和不做处理的细胞作为对照。结果(图6a)显示，IFN-β特异性中和抗体能阻断大部分β干扰素的转录。在阻断抗体处理后，rHep-Flury与Hep-dG感染的NA细胞中IFN-β基因的表达均显著下调，其中rHep-Flury阻断组比正常感染组下调了1.8倍(P<0.05)，而Hep-dG阻断组比正常感染组下调了3.2倍(P<0.01)。在接毒后48 h，收集细胞上清液，检测抗体处理组和未处理组2株RABV的病毒滴度。结果(图6b)表明，IFN-β抗体处理对NA细胞培养上清液中rHep-Flury的子代病毒并无显著性影响，而Hep-dG的病毒滴度显著上调(P<0.01)，约为阻断前的7.9倍。阻断后，Hep-dG的病毒滴度与亲代毒株rHep-Flury没有显著性差异。正常鼠源IgG阴性血清处理对2个感染组的病毒滴度均没有显著影响。说明NA细胞中IFN通路的激活可能是Hep-dG滴度下降的主要原因之一。
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图 6 阻断IFN-β通路对狂犬病病毒复制的影响 Fig. 6 Effect of blocking IFN-β pathway on rabies virus replication a.抗体阻断IFN-β的表达，CK：空白对照，1：rHep-Flury，2：Hep-dG，3：rHep-Flury+IgG，4：Hep-dG+IgG，5：rHep-Flury+Anti，6：Hep-dG+Anti，图中“*”和“**”分别表示直线两端所对应的样本达0.05和0.01的显著水平(t检验)；b.病毒滴度的检测，1：rHep-Flury，2：Hep-dG，3：rHep-Flury+IgG，4：Hep-dG+IgG，5：rHep-Flury+Anti，6：Hep-dG+Anti |
本实验室前期的研究发现携带双G基因的重组狂犬病病毒(RABV)Hep-dG感染NA细胞后滴度明显低于亲代毒株rHep-Flury，而在BHK-21细胞中没有相同现象。前期的蛋白质组研究表明，RABV弱毒病毒G蛋白的过表达与干扰素的诱导呈高度的正相关[11]。本研究检测了不同时间点IFN-β mRNA的表达和干扰素下游因子STAT1的表达和磷酸化水平，结果发现，Hep-dG在感染NA细胞后，能显著上调IFN-β基因的表达，并激活下游因子STAT1的表达和磷酸化。由于BHK-21是RIG-I介导IFN通路的缺陷型细胞[12]，推测2株重组RABV在BHK-21细胞和NA细胞中的病毒滴度差异可能与干扰素通路的激活有关。
RABV感染细胞后，为了逃逸干扰素的作用，通常会采取2种策略：一是通过聚合酶“加帽”[15]，或在入侵细胞后基因组RNA始终被N蛋白缠绕，致使病毒核酸无法释放，从而逃逸PRRs的识别和结合[16-17]；二是通过病毒P蛋白抑制IRF-3的磷酸化，拮抗干扰素的产生[18-20]，或阻止STAT1的入核，从而抑制干扰素刺激基因的表达[21-22]。然而，RABV转录第一步生成的Leader RNA为5＇端三磷酸化、不加帽、不加尾的58 nt单链RNA，能被RIG-I特异性识别并诱导IFN-β的释放[23-25]。Yang等[13]证明，抑制G蛋白表达量可降低RABV的入侵能力，因其减少了RABV Leader RNA的复制量，从而避免了DCs的激活而逃逸了宿主的免疫识别。本研究检测了不同感染复数(MOI)下RABV的吸附和入侵能力，结果发现，当MOI为0.10和1.00时，Hep-dG对NA细胞的吸附能力和入侵能力均明显高于亲代毒株rHep-Flury，说明G蛋白的过表达显著提高了RABV对神经细胞的吸附和穿入能力。然而，与Yang等[13]的推测不同，当MOI为0.01时，Hep-dG进入NA细胞的能力与亲代毒株rHep-Flury无显著性差异，Leader RNA表达量却显著高于rHep-Flury，说明G蛋白的过表达通过其他机制促进了RABV Leader RNA的复制量。此外，检测病毒基因组vRNA和RIG-I基因的表达水平发现，在感染36 h前，细胞内Leader RNA与病毒基因组vRNA的含量趋势一致；在感染36 h后，NA细胞内vRNA的含量继续升高，而Leader RNA的表达水平开始下降。在接毒后36和48 h，Hep-dG感染的NA细胞中RIG-I mRNA的含量显著高于亲代毒株rHep-Flury。细胞内RIG-I的变化趋势与Leader RNA一致，且都与IFN-β mRNA的表达高度一致。由于，rHep-Flury与Hep-dG具有完全相同的Leader RNA序列和二级结构，说明过表达G蛋白通过促进RABV Leader RNA的转录水平，从而激活了RIG-I介导的I型干扰素的激活。
Yang等[11]前期研究发现，G蛋白的过表达也促进了M蛋白的表达。为了证明病毒蛋白本身过表达对干扰素通路的影响，本研究将pH-G和pH-M质粒以5.0和2.5 μg分别转染6孔板NA细胞。结果发现，5 μg的pH-G质粒转染能刺激IFN-β的转录，而5.0和2.5 μg的pH-M质粒均不能刺激IFN-β的转录。说明G蛋白的真核表达在一定程度上也刺激了IFN-β的转录，可能对Hep-dG激活干扰素通路起到一定的作用，而具体作用的机制需要进一步研究。IFN-β特异性抗体处理NA细胞后，rHep-Flury的繁殖无显著影响，而Hep-dG的病毒滴度显著上升，且滴度与亲代毒株rHep-Flury无显著差异。说明NA细胞中干扰素通路的激活是Hep-dG滴度下降的主要原因之一。
RABV G蛋白的过表达通过促进RABV Leader RNA的转录，激活了RIG-I介导的IFN-β通路，进而抑制了Hep-dG在NA细胞的繁殖。此外，G蛋白本身的过表达也对干扰素通路起到一定的作用。本研究初步揭示了G蛋白激活先天性免疫应答的原因和作用，为RABV致病机制的研究奠定了基础。
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