2019, Vol. 40
2. 吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春 130118
2. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
全球盐碱地面积约9.543 8亿 hm2，中国为9 913万hm2，吉林省西部地区的盐碱地面积约170万 hm2，并以每年1.4%的速度增加[1]，这对东北农业的发展造成了严重影响，所以对其开发利用具有非凡意义。实践表明，种植水稻不仅能有效提高苏打盐碱地的利用率[2]，同时也是提高农民收入、农业增效以及改善土地生态环境的最佳方法。赵兰坡等[3]通过“淡化表层”的方法开发盐碱地种植水稻，科研和生产实践表明，盐碱地水田耕层土壤的盐碱含量和碱化度均随水稻种植年限的增加而逐渐降低。
土壤微生物在动植物残体分解和C、N、P、S等元素的生物地球化学循环中起着非常重要的作用[4-5]，土壤微生物种类和数量对环境因子变化和人为干扰的反应十分敏感，能够及时反映土壤理化性质的变化[6-7]。真菌是土壤生态环境的重要组成部分，既可以分解有机物为植物提供养分，保证植物健康生长，也可以改善土壤结构与土壤肥力[8]，影响土壤细菌群落的组成[9]，是生态系统重要组成部分。自然环境中存在的真菌约350~510万种，目前人类认识的仅占5%~10%[10]，说明人类对真菌的认识还远远不够。随着科学技术的不断发展，基于焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术的高通量测序系统已大规模应用[11]，为更全面地了解土壤真菌群落结构多样性提供了技术支持。高通量测序具有分析样本量多和单次运行产生的数据量大等优点[12]，得到很多研究者的青睐。目前，16S/18S/ITS rDNA扩增子测序技术已成为研究环境中微生物群落结构组成的重要手段。
本文通过IlluminaMiSeq测序平台[13]进行ITS rDNA测序，该平台在测序深度、通量、运行周期及测序准确性方面均具有优势，广泛应用于16S/18S/ITS rDNA扩增子测序。近年来，双端读长拼接法使IlluminaMiSeq测序平台的读数达600 bp，分析准确性进一步提高，因此通过该平台对不同种稻年限的苏打盐碱型水稻土进行ITS rDNA测序，更能说明土壤真菌多样性及群落组成变化的真实情况。为深入了解不同种稻年限对苏打盐碱土基本理化性质、真菌多样性及群落结构变化的影响，本研究具有一定的理论意义。
1 材料与方法 1.1 试验地试验地位于中国吉林省前郭县套浩太乡碱巴拉村(124°29'E，44°46'N)，属于中温带大陆性季风气候。年平均气温4.8 ℃，年积温2 800 ℃，年均降雨量450 mm，年均蒸发量1 280 mm，年均日照2 800 h，无霜期135 d[14]。供试土壤为不同种稻年限的苏打盐碱土。
1.2 土壤样品采集2015年秋收后在田间采集水稻土样品。水稻土种稻年限设6个处理：种稻1年、3年、5年、15年、20年和50年。每个处理选3个地块(2 m×2 m)，用对角线五点法采样，然后将样品混合均匀，最后将3个地块的样品充分混匀，装在无菌自封袋中，置于冰盒中带回实验室。新鲜土样用于土壤微生物量碳、硝态氮和铵态氮测定；剩余土样一部分自然风干，研磨过筛，用于土壤其他基本理化性质测定，另一部分保存在–80 ℃冰箱用于DNA提取。
1.3 土壤基本理化性质测定土壤理化性质测定的具体方法参照《土壤农业化学分析方法》[15]进行。pH采用电位法测定m (水)∶m (土)=2.5∶1.0；有机质含量采用重铬酸钾–浓硫酸容量法–外加热法测定；全氮含量采用半微量开氏法测定；硝态氮和铵态氮含量采用流动分析仪测定；速效磷和速效钾含量采用碳酸氢钠和醋酸铵提取法测定；电导率测定按m (水)∶m (土)=5∶1的比例将水土混合均匀，放置过夜，用电导率仪(上海雷磁TM-03型)测定；土壤水溶性盐分总量和总碱度测定前先将土壤样品做如下处理：取20 g土样与100 mL蒸馏水于振荡瓶中振荡3 min，12 000 r·min–1离心10 min后过滤，滤液即是水浸提液，水溶性盐分总量采用总量–质量法测定，总碱度采用电位滴定法测定。
1.4 土壤DNA提取及质量检测按照PowerSoil®DNA提取试剂盒说明书对保存在–80 ℃条件下的土壤样品进行DNA提取，检测提取的DNA浓度及完整性。DNA浓度采用Qubit®2.0荧光定量仪检测，完整性用8 g·L–1的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5 文库构建及IlluminaMiSeq测序高通量测序文库的构建及IlluminaMiSeq平台的测序由ZENEWIZ公司(苏州，中国)完成。以5~50 ng DNA为模板，PCR扩增真菌ITS rDNA上的ITS2可变区，通过PCR向ITS rDNA的PCR产物末端加上带有Index的接头。文库质量的检测采用Agilent 2100生物分析仪(安捷伦，美国)并通过Qubit和实时定量PCR检测文库浓度。DNA文库混合后，根据IlluminaMiSeq仪器说明书进行双端测序，通过MiSeq工具中的MiSeq控制软件进行图像分析与碱基识别，最后在Illuminabasespace云端计算平台进行初始分类分析。
1.6 数据分析采用Excel和SPSS 24.0对土壤基本理化性质数据进行统计及差异显著性分析，采用Canoco 5.0进行冗余分析。双端测序得到的正反向reads首先两两组装连接，过滤拼接结果中含有N的序列，保留长度大于200 bp的序列。经质量过滤，去除嵌合体序列，取最终得到的序列进行OTU分析，使用VSearch 1.9.6进行序列聚类分析，序列相似性设为97%，比对的ITS rDNA参考数据库是unite ITS数据库(https://unite.ut.ee/)。采用核糖体数据库程序分类器贝叶斯算法对OTU代表性序列进行物种分类学分析，并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成。基于OTU的分析结果，对样本序列进行随机抽样，分别计算Shannon和Chao1等α多样性指数，并作稀释曲线。
2 结果与分析 2.1 土壤基本理化性质由表1可知，随种稻年限增加，土壤pH、电导率、总碱度和水溶性盐分总量均显著下降(P<0.05)；有机质与微生物量碳含量随种稻年限增加而显著性升高；全氮、铵态氮和硝态氮含量随种稻年限增加呈升高趋势；速效磷含量在种稻20年时达最大值，之后略有下降；速效钾含量没有明显的变化规律，表现为种稻5年>种稻3年>种稻50年>种稻1年>种稻20年>种稻15年。
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表 1 不同种稻年限苏打盐碱土基本理化性质的变化1) Table 1 Changes of the basic physicochemical properties of soda saline-alkaline soil with different rice planting year |
以随机抽取的ITS有效序列数量为横坐标，OTU数量为纵坐标建立的曲线为稀释曲线[16](图1)。结果表明，有效序列数量为0~5 000时，随有效序列数量增加，OTU数量迅速增加；有效序列数量为5 000~30 000时，OTU数量缓慢增加；有效序列数量大于30 000时，OTU数量基本趋于平缓。随抽取数据量加大，检测到的OTU数量不再增加，说明基本已达饱和状态，此时能够较准确地测定真菌序列数。从图1看出，当有效序列数量达到28 890后，真菌种(属)丰度以种稻5年的处理最高，种稻50年处理最低。
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图 1 不同种稻年限苏打盐碱土真菌稀释曲线 Fig. 1 The dilution curve of fungi in soda saline-alkali soil with different rice planting year |
6个处理的土壤样品测序后共获得403 763条序列，去除32 958条嵌合体序列后剩余370 805条有效序列，其中种稻15年处理的有效序列最多，为92 214条，种稻3年处理最少，为42 482条，种稻1、5、20和50年处理的有效序列数量居于二者之间，分别为56 942、45 987、64 665和68 515条。97%相似性水平下对所有的有效序列进行OTU划分，并进行生物信息学统计分析，共获得OTU数量500个。种稻1、3、5、15、20和50年处理的OTU数量分别为257、283、341、287、300和252个，不同处理的土壤样品共有的OUT数量为81个，特有的分别为3、12、7、30、17和20个。鉴定所得到的真菌门水平有子囊菌门Ascomycota、接合菌门Zygomycota、担子菌门Basidiomycota、壶菌门Chytridiomycota与未知菌门5大菌门(图2)，包括12纲25目26科45属59种。5大菌门的OTU数量分别占OTU总数量的29.56%、10.40%、10.38%、0.12%和49.55%。各处理中这些菌门均有出现，但所占比例有差异，担子菌门随种稻年限的增加显著增多。
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图 2 土壤真菌门水平组成及相对丰度（不含未知门） Fig. 2 Soil fungi composition and relative richness at phylum level excluding unknown phyla |
在属水平上，除未知菌属(87.48%)外，鉴定所得到的45个属中相对丰度大于0.2%的有12个属，分别为枝孢菌属Cladosporium (2.66%)、霍特曼尼菌属Holtermanniella (2.57%)、马氏链球菌属Massariosphaeria (2.08%)、盾壳菌属Coniothyrium (0.97%)、苦苣苔属Khuskia (0.59%)、被孢菌属Mortierella (0.52%)、镰刀菌属Fusarium (0.41%)、地丝霉属Geomyces (0.30%)、顶囊菌属Gaeumannomyces(0.26%)、Mrakia (0.21%)、链格孢菌属Alternaria (0.21%)和毛霉菌属Trichocladium (0.20%)。其余33个属的相对丰度仅占1.73%，并且不同处理土壤真菌群落的组成比例具有明显差异。相对丰度排名前20的真菌属如图3所示。霍特曼尼菌属在种稻15年内均没有出现，但从种稻20年处理的0.11%迅速增加到种稻50年的15.29%，其属于担子菌门，银耳纲Tremellomycetes。
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图 3 土壤真菌属水平组成及相对丰度（不含未知属） Fig. 3 Soil fungi composition and relative richness at genus level excluding unknown genus |
α多样性主要指单样本的多样性分析，反映微生物群落中的物种数目。根据OTU列表中的各样品物种丰度，利用mothur软件计算群落丰富度指数(Ace和Chao1指数)、群落多样性指数(Shannon和Simpson指数)和覆盖率指数(覆盖率)等估计环境群落的物种丰度和多样性。由表2可知，种稻5年处理的Ace和Chao1指数均最大，说明它的物种丰度最高。Shannon指数和Simpson指数越大，群落多样性越高，随种稻年限增加，Shannon指数和Simpson指数均先迅速增加随后逐渐减小，种稻5年处理最大，说明其群落多样性最高。这可能是因为原有微生物对种稻的反应非常敏感，种稻明显影响土壤微生物使其发生变化，直到再次稳定。各样本文库的覆盖率数值越高，样本中序列被测出的概率就越高，表2中各样本文库的覆盖率均不低于99.9%，说明测得的OUT数量能够反映各处理苏打盐碱土壤的真菌群落组成。
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表 2 不同种稻年限苏打盐碱土真菌α多样性指数 Table 2 Fungal α diversity indexes of soda saline-alkaline soil with different rice planting year |
冗余分析可以解释采样点、土壤环境因子和物种三者之间或两两之间的相互关系。由图4看出，种稻1年和种稻3年处理距离较近，种稻1年、3年，种稻5年，种稻15年，种稻20年，种稻50年处理为5个相对独立的群落，说明种稻1年和3年处理的真菌群落相似，其余处理间真菌群落差异较大。环境因子微生物量碳、速效磷、硝态氮、全氮、有机质和铵态氮，pH、电导率、总碱度和水溶性盐分总量之间的夹角为锐角，说明他们之间可能存在相互协同关系。土壤pH、电导率、总碱度以及水溶性盐分总量与毛霉菌属、Mrakia、被孢菌属、隐球菌属Cryptococcus、翅孢壳属Emericellopsis、盾壳菌属、链格孢菌属、干酪酵母菌属Meyerozyma、苦苣苔属、毛球腔菌属Setosphaeria、镰刀菌属、顶囊菌属和Microdochium等真菌菌属数量呈正相关；土壤硝态氮、铵态氮、速效磷、全氮以及有机质含量与上述真菌菌属数量的关系与其相反；土壤微生物量碳含量与霍特曼尼菌属数量呈正相关，说明霍特曼尼菌属受土壤微生物量碳影响很大。土壤pH、电导率、总碱度、水溶性盐分总量以及速效钾含量对大多数真菌菌属的影响相对比较显著，说明土壤碱化程度明显影响了真菌菌属多样性。
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图 4 不同种稻年限土壤真菌群落与环境因子的冗余分析 Fig. 4 Redundancy analyses of fungal communities and environmental factors of soda saline-alkali soil with different rice planting year |
本研究发现，种稻年限显著影响土壤理化性质和真菌群落多样性，pH、电导率、水溶性盐分总量、总碱度、有机质含量和微生物量碳含量等均随种稻年限延长有明显变化。有机质、微生物量碳和其他养分含量的变化，可能与种稻期间为提高作物产量施用的有机肥、无机肥和田间稻秆残留等有一定关系。土壤理化性质的变化可以改善土壤质量，影响土壤微生物的生存环境，从而改变真菌群落的结构。
土壤pH、电导率、总碱度及水溶性盐分总量均可以反映土壤的碱化情况[17-18]。本研究表明，随种稻年限增加，土壤pH、电导率、总碱度以及水溶性盐分总量均显著降低，可能是淹水状态导致耕层土壤的盐分向下渗透，使酸碱度发生变化，同时也影响了电导率、总碱度以及水溶性盐分总量等。种稻50年时，苏打盐碱土的pH降低到8.27，有研究发现种稻2 000年时土壤pH从8.8降低到5.6[19]，虽然本研究的种稻年限有限，但变化趋势却一致。有研究表明，酸性红壤和湖泊围垦种稻30~50年，便可形成高度熟化的水稻土[20-21]。本研究发现种稻5年时，土壤有机质含量已升高至21.54 g·kg–1，说明已形成“熟化耕层”[22]。
目前关于种稻年限影响苏打盐碱土土壤养分及酶活性的研究较广泛[23-24]，但种稻年限影响苏打盐碱土真菌群落结构变化的研究鲜有报道。随种稻年限增加，土壤中真菌的种类和相对丰度都发生了一定变化，这可能是种植水稻后土壤原有的结构和养分等发生了变化，也可能是水稻根系分泌物对某些真菌具有抑制[25]或促进[26]的作用。通过平板稀释法研究不同种稻年限苏打盐碱土的真菌数量，发现种稻年限短的土壤中可培养的真菌数量极少，远不如细菌与放线菌，但随着种稻年限增加，真菌数量明显增多[27]。本研究鉴定所得到的优势菌门为子囊菌门，可能是淹水嫌气条件更适合其生长繁殖[28]。全世界发现的子囊菌门有32 267个种，是真菌中种类最多的一个类群，约占1/3。Al-Sadi等[29]认为，子囊菌门占据比例最大，主要是因为子囊菌可以产生大量的无性孢子，从而快速生长。有研究认为，子囊菌和担子菌是土壤中重要的真菌分解者，担子菌能够很好地降解木质纤维素[30-31]。担子菌门的真菌种类丰富，具有食用和药用价值，也有一些是有害真菌，会使作物产生病害。随种稻年限增加，担子菌门的相对丰度逐渐增加，可能与田间枯枝落叶增多，为担子菌提供了更适宜的生存环境有关。王艳云等[32]在黄河三角洲盐碱地土壤发现子囊菌门相对丰度最高，担子菌门次之，与本研究结果一致。冗余分析表明土壤pH、电导率、总碱度、水溶性盐分总量和速效钾含量对种稻后苏打盐碱土真菌群落的影响大于其他环境因子，这与多数研究[33-35]观点一致。
本研究表明，种稻年限对苏打盐碱土理化性质有很大影响。种稻年限的增加能够显著降低苏打盐碱土中pH、电导率、总碱度以及水溶性盐分总量，减轻土壤碱化程度，同时提高土壤硝态氮、全氮、有机质和微生物量碳等养分的含量。不同种稻年限土壤理化性质发生了改变，土壤中真菌所占比例也不相同，从门水平看，主要有子囊菌门、接合菌门、担子菌门和未知菌门，相对丰度均大于10%，其中担子菌门的相对丰度随种稻年限增加而增加；从属水平看，枝孢菌属、霍特曼尼菌属、马氏链球菌属以及未知菌属为优势菌属，相对丰度大于2%，霍特曼尼菌属在种稻20年时才出现，种稻50年处理中所占比例达到了15.29%。α多样性指数分析指出，真菌群落多样性随种稻年限增加先增加后逐渐减小，种稻5年时真菌多样性指数最大，真菌群落多样性最高。冗余分析得出土壤pH、电导率、总碱度、水溶性盐分总量和速效钾含量是影响真菌群落多样性主要的环境因子。
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