甜、糯玉米是世界上非常重要的鲜食玉米类型，其产量和产值均位居蔬菜作物前列。甜、糯玉米是广东省具有优势和特色的农作物，经济效益高，已形成重要的产业^[1]，至2014年，甜玉米种植面积已增至22.0 万hm²，产量为310.2万t，分别占全国甜玉米种植面积的66.1%和产量的62.1%^[2]。经过多年的发展，我国已成为全球最大的鲜食玉米种植国、生产国、加工国和消费国，据2016年统计，全国鲜食玉米总种植面积达133.33万hm²，其中糯玉米80万hm²，甜糯玉米13.33万hm²，甜玉米40万hm^2[3]。

甜玉米由控制胚乳碳水化合物转化的一个或多个相关基因发生隐性突变形成，是隐性胚乳突变体。迄今为止，世界范围内已发现多个玉米胚乳隐性突变体基因，如su₁、su₂、sh₁、sh₂、bt₁、bt₂、se等^[4]。在灌浆期和乳熟期，这些突变体基因可以使胚乳中淀粉合成受阻，从而使籽粒中可溶性糖大量积累，淀粉则显著减少。糯玉米起源于我国西南地区的西双版纳和广西亚热带地区，由普通玉米中的wx基因发生隐性突变形成^[5]，其淀粉由95%~100%的支链淀粉组成，具有较强的黏性和糯性，果穗成熟后呈非透明、无光泽的蜡质状，所以糯玉米也被称作蜡质玉米。

随着经济的持续发展和生活水平的提高，人们对鲜食玉米需求量增加的同时，对其品质也提出了更高要求，出现了一种新的鲜食玉米类型，即甜加糯型鲜食玉米。甜加糯玉米最早由著名玉米育种家谢孝颐先生提出，利用糯玉米与甜玉米杂交分离出糯超甜双隐性株系，再与糯玉米杂交可收获包含糯与甜糯2种籽粒类型的新型玉米^[6-7]。甜加糯型玉米表现为同一果穗上既有甜玉米籽粒也有糯玉米籽粒，兼有甜、糯2种口味，市场份额逐年上升^[8-9]。

wx基因和其他多个胚乳隐性基因间存在互作，ae、du和wx 3个基因隐性纯合时蔗糖含量高达23.7%，但它们单独存在时蔗糖累积很少，su和wx双基因隐性纯合时可溶性糖高达47.5%^[10]。李新海等^[11]报道，3对SSR引物phi022、phi027、phi061与糯玉米隐性基因wx紧密连锁，杨耀迥等^[12]利用这3对SSR引物进行分子标记辅助选择，成功选育出9个甜糯双隐性纯合自交系。本研究探索应用分子标记辅助育种技术快速选育甜糯双隐性玉米自交系的技术和方法，并对选育的甜糯双隐性基因玉米材料进行品质鉴定与评价，旨在提高甜糯玉米育种效率，为促进甜糯玉米育种提供技术支撑。

1 材料与方法 1.1 材料

选用由华南农业大学农学院甜玉米课题组选育的1份甜玉米骨干系M01(sh₂sh₂)和3份糯玉米自交系L33、L35和L38(wxwx)为亲本材料，于2013年春季杂交得到F₁代，2013年秋季F₁代种子自交获得F₂代，果穗籽粒性状分离，表现为甜(sh₂sh₂)、糯(wxwx)和普通(wxsh₂)3种玉米籽粒类型，表型为皱缩和非皱缩籽粒分离，选择皱缩籽粒留种。2014年春季，选择F₂种子中留种的皱缩籽粒播种，在苗期取幼嫩叶片提取全基因组DNA，用SSR标记鉴定基因型为wxwxsh₂sh₂的甜糯双隐性单株，挂牌并自交，获得甜糯双隐性基因型F₃代种子。2014年秋季种植F₃代种子，选择表型相对一致的株系自交，得11个F₄代甜糯双隐性基因型自交系。2015年春，将这11个F₄代甜糯双隐性自交系与甜、糯玉米亲本采用随机区组试验设计种植于华南农业大学增城试验基地，每个小区行长2 m，宽0.67 m，株距0.3 m，行距0.5 m，每个自交系种植2行，3次重复，采用常规大田管理技术，于乳熟期检测籽粒可溶性糖含量、总淀粉含量及果皮厚度，并与亲本进行比较分析。

1.2 试剂

主要试剂Taq DNA聚合酶、dNTPs、Buffer、MgCl₂等均购自广州东盛生物科技有限公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 DNA提取

于大喇叭口期采集F₂代单株幼嫩叶片，采用改良CTAB法^[13]提取叶片全基因组DNA，用1×TE稀释至25 mg·L^–1，于–20 ℃冰箱中保存备用。

1.4 引物及PCR反应体系

用于扩增wx基因的SSR引物引自前期研究^[11-12]，序列来源于Maizegdb网站http://www.maizegdb.org，引物序列详见表1。PCR反应通过PTC-100TM型PCR仪完成，反应总体系为20 μL^[14]：50~60 ng·μL^–1的玉米材料基因组DNA 2.00 μL，10× PCR Buffer(含Mg²⁺)2.00 μL，25 mmol·L⁻¹的 dNTPs 1.20 μL，2 U·μL^–1的Taq酶0.50 μL，30 ng·μL⁻¹的Primer(Primer F和Primer R)各0.60 μL，ddH₂0 13.10 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min，引物phi022、phi027和phi061的退火温度分别为57、60和61 ℃。

1.5 乳熟期籽粒可溶性糖及淀粉含量检测

雌穗套袋控制授粉时间，于授粉后22 d，11个自交系株系和每份亲本材料取3个果穗，用镊子或刀片剥取完好的玉米籽粒，并选取大小相对一致的籽粒为试验材料。准确称取20 g玉米籽粒，匀浆，加入20 mL蒸馏水，搅拌均匀后10 000 r·min^–1离心10 min，取上清液。向离心管剩余的固体中添加20 mL蒸馏水，搅拌均匀后再次10 000 r·min^–1离心10 min，合并2次上清液，移至250 mL容量瓶中定容，制成玉米可溶性糖提取液。按照蒽酮法^[15]测定甜玉米籽粒中可溶性糖含量，淀粉含量测定按照NY/T 11—1985标准^[16]进行。

1.6 鲜玉米籽粒果皮厚度的测量

套袋授粉22 d后，每份材料取3个果穗，每个果穗取中部5颗籽粒，每颗籽粒分别取顶部和背胚部2 mm×2 mm大小的果皮，采用常规石蜡组织切片技术制片，果皮取材后立即放入FAA固定液，固定后经体积分数为50%、70%、85%、95%和100%的乙醇逐级脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片，展片，染色和封片，在Primo Star光学显微镜(Zeiss，德国) 400×下观察并拍照。

1.7 数据统计与分析

PCR扩增结果有带记为1，无带记为0，采用Excel 2007进行χ²分析。可溶性糖及淀粉含量：在波长620 nm下比色，分别记录光密度值(D_{620 nm})，查标准曲线得知对应的葡萄糖质量(m/μg)，用以下公式计算甜玉米籽粒中可溶性糖及淀粉含量：

$ \begin{aligned} w \left({ \text{可溶性糖}} \right) =km/10^6 M \times 100{\text{%}}, \end{aligned}$

(1)

$ \begin{aligned} w \left({\text{淀粉}} \right) ={KD_{620\; {\rm{nm}}}}/203LM\times 100{\text{%}}, \end{aligned}$

(2)

式中：k和K为稀释倍数；M为样品质量，g；L为比色管长度，dm。

果皮厚度在显微镜下测量3次，取平均值，精确到1 μm。采用Excel 2007进行统计分析，用SAS V8.0进行t检验。

2 结果与分析 2.1 wx基因的功能标记筛选

对与糯玉米隐性基因wx紧密连锁的3对SSR引物phi022、phi027、phi061在1份甜玉米骨干系M01和3份糯玉米自交系L33、L35和L38之间进行多态性筛选(图1)，发现引物phi022和phi027在甜玉米和糯玉米亲本间表现无差异，引物phi061的扩增条带清楚完整且差异明显，表现为共显性，因此选择引物phi061鉴定3个F₂分离群体中的甜糯双隐性植株(图2)。由于引物phi061为共显性标记，可以鉴定出WxWx显性纯合基因个体、Wxwx杂合基因个体和wxwx隐性纯合基因个体，由图2看出，在来自杂交L35×M01的F₂群体中与糯玉米亲本L35条带处于同一位置且仅为单带的共有4个单株(泳道1、8、11和12)，这4个单株的基因型为wxwxsh₂sh₂，仅对含有甜糯双隐基因的单株自交以减少工作量。

2.2 功能标记在F₂代群体中的χ²分析

对3个F₂群体后代中糯质基因的分离比例进行χ²分析(表2)，糯质隐性纯合植株与非隐性纯合植株的理论比例为1︰3。L33×M01的F₂代群体的χ²为0.03，L35×M01的F₂代群体的χ²为0.40，L38×M01的F₂代群体的χ²为0.01，其对应的概率P均大于0.05，差异不显著，表明糯质基因的分离比例符合理论比例。以上结果显示3个分离世代基因型的分离比例均符合孟德尔遗传定律，表明运用该功能标记对3个F₂代群体隐性纯合单株的选择有效，甜质基因与糯质基因间不存在连锁关系。在3个F₂群体中成功鉴定出基因型为wxwxsh₂sh₂的甜糯双隐性纯合植株分别为3、4和8株，共计15株，经两代自交，实际得到11个甜糯双隐性基因型自交系。

2.3 甜糯双隐性自交系材料的可溶性糖含量分析

F₄代甜糯双隐性自交系L1~L11及甜、糯质亲本可溶性糖含量测定结果如表3显示。11份自交系材料的可溶性糖质量分数平均为12.27%，标准差平均为1.61%，变异系数平均为0.13，可溶性糖质量分数平均变幅为8.65%~16.77%；甜质亲本的可溶性糖质量分数平均为9.72%，标准差平均为0.67%，变异系数平均为0.07，可溶性糖质量分数平均变幅为9.25%~10.49%；3个糯质亲本的可溶性糖质量分数平均为3.51%，标准差平均为0.86%，变异系数平均为0.25，可溶性糖质量分数平均变幅为1.15%~6.78%。11份甜糯双隐性自交系材料的可溶性糖质量分数均高于对应的甜、糯质亲本，其中质量分数最高的是株系L6，为14.15%，最低的是L38，为1.64%。

对11份甜糯双隐性自交系与对应亲本的可溶性糖含量差异进行t检验，结果如表4所示。除了株系L2、L5和L8外，其余8份自交系的可溶性糖含量均显著高于甜质亲本(P<0.05)；11份自交系的可溶性糖含量均极显著高于糯质亲本L33、L35和L38(P<0.01)。

2.4 甜糯双隐性自交系材料的淀粉含量分析

甜糯双隐性自交系L1~L11及甜、糯质亲本的淀粉含量如表5所示。11份自交系材料的淀粉含量(w)平均为19.73%，标准差平均为1.50%，变异系数平均为0.08，淀粉含量平均变幅为15.67%~23.78%；甜质亲本的淀粉含量(w)平均为23.50%，标准差平均为1.71%，变异系数平均为0.07，淀粉含量平均变幅为21.92%~25.31%；3个糯质亲本的淀粉含量(w)平均为47.34%，标准差平均为5.25%，变异系数平均为0.11，淀粉含量平均变幅为41.59%~57.08%。11份自交系淀粉含量均低于对应的甜、糯质亲本，其中含量(w)最高的是株系L6，为22.50%，含量最低的是株系L8，为16.60%。

对11份甜糯双隐性自交系与对应亲本的淀粉含量差异进行t检验，结果如表6所示。除了株系L1、L3、L4、L6和L9外，其余6份自交系的淀粉含量显著低于甜质亲本M01(P<0.05)；11份自交系的淀粉含量均极显著低于3个糯质亲本(P<0.01)。

2.5 甜糯双隐性玉米材料的果皮厚度分析

11份甜糯双隐性自交系与甜、糯质亲本的果皮厚度如表7所示。11份自交系材料籽粒冠部果皮厚度平均为40.83 μm，标准差平均为5.37 μm，变异系数平均为0.07，冠部果皮厚度平均变幅29.95~52.01 μm；甜质亲本冠部果皮厚度平均为28.07 μm，标准差为0.11 μm，变异系数平均为0.12，冠部果皮厚度平均变幅为24.19~32.89 μm；3个糯质亲本冠部果皮厚度平均为60.34 μm，标准差为5.13 μm，变异系数平均为0.04，冠部果皮厚度平均变幅为50.71~65.93 μm。3个杂交组合(L33×M01、L35×M01和L38×M01)双亲籽粒冠部果皮厚度平均分别为45.38、45.97和41.26 μm，11份自交系籽粒冠部果皮厚度与对应亲本的果皮厚度均值相近。11份自交系籽粒背胚侧果皮厚度平均为59.68 μm，标准差平均为10.43 μm；甜质亲本背胚侧果皮厚度平均为38.02 μm，标准差为0.10 μm；糯质亲本背胚侧果皮厚度平均为81.17 μm，标准差为15.39 μm。甜糯双隐性自交系材料背胚侧果皮厚度多介于双亲背胚侧果皮厚度之间。

3 讨论与结论

随着人们生活水平的提高，对鲜食玉米的营养和口味提出了更高的要求。近年来，一种兼有甜、糯2种风味的新型鲜食玉米品种，即甜糯玉米应运而生，成为鲜食玉米市场的新宠^[17]。甜糯玉米一般以糯玉米自交系为母本，甜糯双隐性玉米自交系为父本，F₂代果穗中有1/4的甜糯玉米籽粒，3/4的糯玉米籽粒^[6-7]。选育甜糯双隐性玉米自交系是培育甜糯玉米品种的关键，由于甜质基因sh₂和糯质基因wx要均为隐性纯合时方能表达，因此存在选育过程长、效率低的问题。sh₂基因隐性纯合时，种子皱缩凹陷，表型明显，但2个基因均隐性纯合时，种子淀粉含量少，通过碘–碘化钾染色法判断甜糯双隐性材料存在一定的困难，利用分子标记辅助选择可以较好地解决这一问题。

分子标记辅助选择是利用分子标记对作物进行改良的一种手段^[18]，其基本原理是通过与目标基因紧密连锁或共分离的功能标记锁定目标基因，利用其他分子标记进行全基因组的筛选，以便快速恢复轮回亲本的背景基因，减少连锁累赘，迅速获得期望个体^[19-20]。目前该技术已广泛应用于各种作物的品种改良^[21-22]和聚合育种^[23-24]。应用分子标记辅助选育甜糯双隐性材料由李新海等^[11]在2003年提出，发现3对SSR引物与糯玉米隐性基因紧密连锁。杨耀迥等^[12]应用分子标记辅助选择从3个甜糯玉米品种的杂交组合中选育了9份甜糯纯合双隐性玉米材料，引物phi022在亲本间检测出多态性，连续自交4代得到了甜糯双隐性材料。本研究中引物phi061在甜、糯玉米亲本间检测出多态性，以甜、糯玉米自交系为材料，后代的分离相对于品种间杂交较小，在F₄代得到了纯合的甜糯双隐性自交系。

目前已有一些关于甜糯双隐性玉米材料品质评价的报道^[25]。郝小琴等^[25]分析了甜糯双隐性基因玉米材料的农艺性状和可溶性糖含量，发现大部分双隐性材料在授粉后15~30 d可溶性总糖含量高于对应的甜玉米和糯玉米亲本。郝小琴等^[26]研究发现双隐性纯合体的可溶性糖含量最高，其次为甜糯玉米杂交种，单隐性纯合体最低。本研究发现甜糯双隐性玉米材料的可溶性糖平均含量高于甜玉米亲本，远高于糯玉米亲本，与前人研究结果一致；淀粉的平均含量低于甜玉米亲本，远低于糯玉米亲本；乳熟期籽粒冠部和背胚部的果皮厚度介于两亲本之间。

甜糯玉米作为一种鲜食玉米类型，营养品质和柔嫩度品质均非常重要，可溶性糖和淀粉是其主要的营养成分，柔嫩度与果皮厚度呈显著负相关^[27]。本研究利用sh₂基因的表型和wx基因的紧密连锁标记，对甜玉米和糯玉米自交系杂交F₂代进行选择并自交选育11个甜糯玉米双隐性材料，并对其品质进行了较为全面的评价。应用分子标记辅助选育甜糯双隐性玉米种质明显缩短了育种周期，减少了田间工作量，对双隐性材料的品质评价以及开展甜糯玉米自交系选育时的亲本选择提供了参考，这对优质甜糯玉米育种有重要的指导意义。