2019, Vol. 40
柑橘黄龙病(Huanglongbing, HLB)是一种具有毁灭性和传染性的全株系统性病害，严重影响柑橘果实的品质和产量[1-3]。目前没有能够根治黄龙病的方法[4-5]。柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama隶属半翅目Hemiptera木虱科Psyllidae，是已知田间传播柑橘黄龙病最重要的虫媒，加强对木虱的防治是控制或降低黄龙病发病与蔓延的关键 [6-7]。目前，我国防治柑橘木虱最常用的方法为化学防治。由于木虱在柑橘的整个生长期都有发生风险，国内柑橘种植区每年喷药防治柑橘木虱的次数少则12次、多达20次[8]，农药使用次数和使用量的加大，必然会带来严重的抗药性和环境污染等一系列问题。农药减量增效是我国农业可持续发展的重要保障，新的导向施药方式的推广和应用能够有效降低农药使用量和农药对环境的影响。滴灌施药作为一种导向的施药方式，将农药定向施于植物根部区域进而防治病虫草害。有研究表明，将水溶性熏蒸剂滴灌施用于草莓园，能有效防治土壤害虫，增加了农药有效利用率，并且更加安全环保[9]。滴灌施用氯虫苯甲酰胺经作物根部吸收，通过木质部转运至地上部，能够有效防治棉铃虫，并且一次滴药的效果优于多次喷雾施药[10]。目前，滴灌技术在柑橘园的应用日益普及，但国内滴灌施药防治柑橘木虱研究鲜见报道[11]。本文通过滴灌施药方式，研究了噻虫胺对柑橘木虱的防治效果，以明确滴灌施药防治柑橘木虱的可行性，为柑橘木虱防治提供新的有效手段。
1 材料与方法 1.1 供试材料柑橘品种为年橘Citrus reticulate cv. Nianju，购自广东省惠州市惠东县人民政府水果生产办公室。植株为种植袋中生长1年的年橘苗，株高(96.40±2.99) cm，冠幅直径(53.80±2.82) cm，径粗(9.40±0.40) mm；种植袋大小为上径38 cm，下径27 cm，高30 cm。室内试验在华南农业大学资源环境学院楼顶的网室内进行，水肥管理按照正常水平。柑橘木虱采自华南农业大学茶山区住宅楼下的九里香Murraya exoticaL.上，置于人工气候箱中饲养，饲喂健康九里香叶片，饲养条件：温度(26±1) ℃，相对湿度70%~80%，光照时间14 h光∶10 h暗。50%噻虫胺水分散粒剂，由江苏腾龙生物药业有限公司提供；色谱级有机溶剂购自北京迈瑞达科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 室内模拟滴灌施药试验 1.2.1 施药方式采用输液器和塑料瓶模拟滴灌装置，调节流速为2 L·h–1。按照田间已有的噻虫胺推荐用药量，将0.2 g噻虫胺(有效成分)溶于400 mL清水中，通过滴灌方式进行施药。以清水为对照，每个处理重复3次。
1.2.2 生测试验采集药后2、4、6、8、10、20、30、40、60、80、100、120 d的柑橘叶片。每株采集2片大小基本一致的叶片，每处理组采集3株。用清水将叶片冲洗干净，擦干水。叶柄插入含1.5 mL水的离心管中，封口膜封好离心管口，然后将叶片放入50 mL尖底离心管中，每个离心管中接入10头木虱成虫。将离心管放入人工气候箱中，与饲养木虱的条件一致，以96 h的校正死亡率作为防治效果[12]。
1.2.3 叶片、土壤样品采集取药后10、20、30、40、60、80、100和120 d的柑橘上部叶片进行噻虫胺含量分析。土壤样品为药后2和45 d采集距离滴头水平方向和垂直方向均为0~15 cm的土壤，间隔距离为5 cm，土壤样品采集示意图见图1。对土壤样品进行缩分，剔除土壤中的石块和杂草后过筛混合均匀，装入自封袋中，于–20 ℃保存，待测。
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图 1 土壤样品采集示意图 Fig. 1 The schematic diagram of collecting soil samples |
试验地点为广东省惠州市龙门县永汉镇柑橘种植园(N23°34′6.92″，E113°58′24.59″)。植株为种植1.5年的年橘，冠幅直径151.79 cm，株高143.71 cm，种植密度约1 650株·hm–2。药剂为w=50%的噻虫胺水分散粒剂，每株柑橘用药量为1.0 g噻虫胺，田间水肥管理按照常规方式进行。每个小区6株柑橘树，重复3次。试验时间为2016年9月至2017年1月。
果园装有滴水灌溉系统，沿着柑橘树种植方向，在柑橘树两侧滴水线位置各铺设一条滴灌带，每棵树的两侧各有2个滴头，滴灌带直径1.5 cm，滴头流量为2 L·h–1。以电动喷雾器模拟小型施药池，电动喷雾器的喷头经过改装后与滴灌带连接，调整喷雾器的出水压力。每组处理用72 L的水溶解稀释药剂，药剂在塑料桶中溶解搅拌均匀后倒入电动喷雾器中，进行滴灌施药。在滴灌施药前每个小区先滴清水100 L，然后进行滴灌施药，药后滴清水50 L冲洗管道。
采集药后1、3、7、14、21、35、49、63、77和91 d柑橘树上、中、下部的叶片，沿着柑橘树东南西北的每个方位各取2个嫩梢，每组随机选择4株柑橘树进行采样，检测叶片中噻虫胺的含量。
1.4 噻虫胺含量的分析方法 1.4.1 叶片样品称取样品2 g(精确到0.01 g)于50 mL带塞离心管中，加入2 mL水润湿，再加入5 mL乙腈，涡旋提取2 min，加入0.5 g氯化钠和2 g无水硫酸镁，立即手摇震荡混匀，涡旋1 min。3 500 r·min–1低速离心5 min。吸取上清液1 mL至装有20.0 mg MWCNTs+50.0 mg PSA+150.0 mg无水硫酸镁的2 mL塑料离心管中，涡旋20 s，高速离心1 min后，上清液经0.22 μm滤膜过滤，待测。
采用TSQ-Quantum Ultra液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测叶片中噻虫胺含量。条件：Hypersil GOLD色谱柱，流动相为V(乙腈)∶V(含体积分数0.1%甲酸的水)，采用梯度洗脱(30∶70，0~2.0 min；30∶70变化至90∶10，2.0~3.0 min；90∶10，3.0~4.5 min，由90∶10变化至30∶70，4.5~4.6 min；30∶70，4.6~6.5 min)，流速为0.4 mL·min–1，进样量为5 μL，柱温为30 ℃。
质谱条件：喷雾电压为3 500 V，传输毛细管温度为300 ℃，雾化温度为300 ℃，碰撞气压力为1.2 mTorr，鞘气压力为35 bar，辅助气压力为15 bar，电离方式为电喷雾离子化(ESI)，正离子模式。扫描方式为选择反应监测扫描(SRM)。噻虫胺保留时间1.29 min，母离子(m/z)250.0，子离子(m/z)169.1。
线性相关性测定：将噻虫胺用基质配制成15、12、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 mg·L–1的标准溶液，经LC-MS/MS测定，噻虫胺的标准曲线符合方程y=401 550x–91 187，R2=0.999 8，相关性好, 满足定量分析要求。
1.4.2 土壤样品称取样品10 g(精确到0.01 g)于100 mL离心管中，加入5 mL去离子水润湿，再加入40 mL乙腈，涡旋振荡3 min，超声20 min，于4 000 r·min–1的转速下离心 5 min，取上清液于装有4 g氯化钠的50 mL离心管中，涡旋振荡5 min，静置30 min使乙腈和水分层，取30 mL乙腈在45 ℃左右旋转蒸干，加入2 mL色谱乙腈洗脱。取1 mL洗脱液至装有100.0 mg PSA+100.0 mg C18+100.0 mg无水硫酸镁的2 mL离心管中，涡旋振荡1 min，在13 000 r·min–1的转速下离心5 min，吸取上清液过0.22 μm有机滤膜，待测。
采用Agilent 1100高效液相色谱检测土壤中噻虫胺的含量。TC-C18 反相色谱柱，流动相为V(乙腈)∶V(水)=25∶75，检测波长为254 nm，流速为1.0 mL·min–1，进样量为10 μL，柱温为30 ℃。
线性相关性测定：将噻虫胺用色谱乙腈配制成100、50、25、10、5、2.5、1、0.5 mg·L–1的标准溶液，经液相色谱测定，噻虫胺的标准曲线符合方程y=37.978x−14.937，R2=0.999 9，满足色谱分析定量要求。
1.4.3 添加样品回收试验称取空白叶片样品2 g(精确到0.01 g)于50 mL带塞离心管中，向样品中添加噻虫胺的标准溶液，添加质量分数分别为2.500、0.250、0.025 mg·kg–1，5个重复。按照上述处理步骤进行提取、净化和液质检测。
称取空白的土壤样品10 g(精确到0.01g)于100 mL离心管中，向样品中添加噻虫胺的标准溶液，添加质量分数为25.00、5.00、0.50 mg·kg−1，5个重复。按照上述处理步骤进行提取、净化和液相检测。
1.5 数据处理采用SPSS 20.0软件和Microsoft Office Excel 2010软件处理数据，差异显著性分析采用Duncan’s法，使用Origin 9.0制作图形。
2 结果与分析 2.1 添加回收率由表1可知，当空白叶片样品中噻虫胺的添加质量分数为0.025、0.250和2.500 mg·kg–1时，噻虫胺的平均回收率为89.94%、96.72%和104.17%，RSD分别为16.75%、2.89%和1.54%。当空白土壤样品中噻虫胺的添加质量分数为0.5、5.0和25.0 mg时，噻虫胺的平均回收率为82.97%、84.48%和92.15%，RSD分别为6.02%、2.67%和7.59%。表明噻虫胺的分析方法均符合农药残留分析的要求。
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表 1 噻虫胺在柑橘叶片和土壤中的添加回收率
Table 1 Recovery rates and relative standard deviations (RSD) of clothianidin in citrus |
采集药后柑橘上部叶片饲喂柑橘木虱，结果见图2A。滴灌施药后，柑橘木虱的校正死亡率逐渐升高，药后6 d，噻虫胺对柑橘木虱的防效为75.70%±9.05%；药后8~100 d噻虫胺对木虱的防效均大于90%；药后120 d，柑橘木虱的校正死亡率开始降低，防效为82.45%±1.30%。表明在室内条件下，一次滴灌施用噻虫胺对柑橘木虱的防治效果可达4个月。
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图 2 噻虫胺对柑橘木虱的防治效果及在柑橘叶片中的含量变化 Fig. 2 The control efficacy of clothianidin on citrus psyllid and clothianidin content in citrus leaves 各图中柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05, Duncan’s 法) Different lowercase letters on the bar of each figure indicated significant difference (P<0.05, Duncan’s method) |
为明确防治效果与叶片中药剂含量之间的关系，检测分析了柑橘叶片中的噻虫胺含量，结果见图2B。在药后10~120 d，噻虫胺在叶片中的含量总体呈先升高后降低趋势。在药后40 d，叶片中噻虫胺质量分数达到最高，为(7.78±0.84) mg·kg–1；随后逐渐降低，药后120 d叶片中噻虫胺质量分数为(0.64±0.11) mg·kg–1。由防效结果(图2A)可知，在药后10 ~120 d噻虫胺对柑橘木虱的防治效果均高于80%，结合叶片中的药剂含量，表明滴灌施药后当叶片中的含量大于0.64 mg·kg–1时，能够有效防治柑橘木虱。
2.2.3 噻虫胺在土壤中的分布为明确滴灌后噻虫胺在土壤中的分布，采集了药后2 h和45 d的土壤样品进行检测分析，结果见表2。在药后2 h噻虫胺主要分布在距离滴头水平和垂直方向均为0~10 cm的土壤范围内，迁移速率相差不大。在药后45 d，噻虫胺逐渐向远离滴头的方向迁移，噻虫胺在距离滴头水平方向0~5 cm、垂直方向0~15 cm(即第一纵列)和距离滴头水平方向0~15 cm、垂直方向0~5 cm(即第1横行)的范围内其含量逐渐升高。噻虫胺在上、中、下3层土壤中噻虫胺质量分数最大值分别为1.74、3.81和4.08 mg·kg–1，且三者所在的位置在土壤中呈一斜线，即以滴头为起始点，噻虫胺在土壤中呈半圆形迁移分布。
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表 2 离滴头不同距离的土壤中噻虫胺的分布1) Table 2 The distribution of clothianidin in soil at different distance from emitter |
柑橘园对柑橘木虱的治理以预防为主。对柑橘园进行滴灌施药，采集柑橘树上、中、下部的叶片，检测噻虫胺在叶片中的含量，结果如图3所示。在田间条件下，噻虫胺在植株叶片中的分布整体趋势为上部叶＞中部叶＞下部叶。滴灌施药后35 d内，噻虫胺在叶片中的含量逐渐升高，上、中、下部叶片中噻虫胺质量分数最大值分别为2.04、1.26和0.98 mg·kg–1(df=8, F=7.169, P=0.048)。在药后35~91 d噻虫胺在叶片中的含量逐渐降低，在药后91 d上、中、下部叶片中噻虫胺质量分数分别降至0.40、0.12和0.08 mg·kg–1(df=8, F=25.462, P=0.005)，分别为最大值的19.61%、9.52%和8.16%。在药后7~63 d，上部叶片中噻虫胺质量分数为0.61~2.04 mg·kg–1。室内模拟滴灌试验表明，当叶片中噻虫胺质量分数大于0.64 mg·kg–1时，对柑橘木虱的防治效果达80%以上，因此在田间条件下进行滴灌施药防治或预防柑橘木虱是可行的。
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图 3 噻虫胺在田间柑橘植叶片中的分布 Fig. 3 The distribution of clothianidin of citrus leaves in field |
柑橘木虱喜取食柑橘、九里香的嫩梢，在柑橘树上相对聚集度较高，雌虫多将卵产于嫩芽的缝隙中，传统喷雾药剂难以有效接触[13-14]；另外，柑橘木虱在柑橘的整个生长期都有发生风险，而柑橘木虱的种群动态与嫩梢的生长密切相关，抽梢越多柑橘木虱密度越大[15-16]。目前柑橘园通常采用多次大量喷施杀虫剂防控柑橘木虱的发生，这必然引起对天敌昆虫的杀伤、木虱抗药性以及农药残留超标等一系列问题。本研究表明，在室内一次滴灌施药，8 d后防治效果能达到90%，并能够实现对柑橘木虱长达4个月的防治效果。
在田间滴灌施药条件下，噻虫胺在药后63 d内叶片中的含量可有效预防柑橘木虱的发生，且上部叶中的含量高于中下部叶，这一现象对化学防治柑橘木虱具有重要生物学意义。造成这一现象的原因可能是：1)由于柑橘上部叶片生命力旺盛，需要更多的养分和水分，形成了一个较强的库；同时，上部叶片具有更好的光照和通风条件，有利于叶片的蒸腾作用，从而使得上部叶片药剂含量较高。有文献报道，吡虫啉和久效磷通过树干注射后，其在植物体内上部叶含量明显高于下部叶[17-18]。2)具有韧皮部输导性的农药分子能够在植物体内进行再分配，从而向上部幼嫩部位积累。例如，叶片施用2, 4–D和草甘膦后，在蚕豆和蓖麻上表现出明显的顶端积累[19-20]。
滴灌施药是将农药溶于灌溉水，借助现有的滴水灌溉系统进行施药的方式。目前滴灌施药应用越来越广泛[21]。与叶面喷雾和浇灌相比，滴灌施药不仅可以代替叶面施药或减少用药量，而且可以降低对非靶标生物的影响，在浇水、施肥的同时将农药定向均匀地施于作物根部，实现了水肥药一体化，从而大大降低农业生产的投入成本，省时省力[22]。药剂的理化性质影响滴灌后农药在土壤中的迁移分布，决定农药是否能够到达靶标区域，进而对农药的使用效果产生影响[23]。本研究结果表明，噻虫胺随着水分在土壤中迁移，以滴头为起点呈半圆形分布。柑橘的根系呈球形分布，须根系分布在外围，噻虫胺在土壤中的分布特点有利于柑橘须根系对药剂的吸收。
噻虫胺属于新烟碱类农药，具有优越的内吸性，可防治半翅目、鞘翅目和某些鳞翅目害虫，尤其对刺吸式害虫具有低剂量高防效的特点，现已有登记产品将其进行灌根、喷淋、撒施或拌种等用于防治田间害虫[24]。Langdon等[25]报道噻虫胺对柑橘木虱的胃毒活性LC50为0.09 mg·L–1、LC90为9.35 mg·L–1。本研究叶片中噻虫胺的质量分数为0.64 mg·kg–1时对柑橘木虱的防效大于80%，此药剂浓度位于Langdon等[25]报道的LC50和LC90之间。在我国，有报道将30%噻虫胺·除虫脲悬浮剂通过喷雾能有效防治柑橘木虱15 d以上[26]；而国外有研究表明将噻虫胺进行浇灌，在药后10 d柑橘木虱的死亡率达到80%，在温室内持效期可达90 d[27]。本研究中噻虫胺通过滴灌施药在室内防治柑橘木虱能够持续120 d。新烟碱类农药会对蜜蜂等传粉昆虫产生影响，使得其在某些国家和地区已经被禁用或限用，也有研究表明噻虫胺不会对蜜蜂产生不利影响[28]。因此，滴灌施用噻虫胺后，其在柑橘花粉和果实中的含量以及对蜜蜂的影响值得进一步深入研究。
致谢：广东省农业科学院果树研究所吴文研究员以及华南农业大学园艺学院陈杰忠教授给予指导，谨致谢意！
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