2019, Vol. 40
动物消化道存在着数目庞大且种类丰富的微生物，这些微生物组成的群落在动物的营养、免疫、生理和代谢等方面发挥着巨大作用[1]。肠道菌群的多样性能够保证肠道微生物区系平衡，维持胃肠道环境相对稳定，促进营养物质消化吸收[2]。家禽的大肠很短，食糜会很快进入盲肠，所以盲肠是微生物生存和活动的重要场所，通过调控菌群的多样性，能够改善家禽肠道健康，提高生产性能。Pan等[3]利用高通量测序法分析家禽的肠道微生物组成及其与宿主和饮食的相互作用，结果显示肠道微生物组成受到饮食的影响比较大。刘蓓一[4]研究发现盲肠中微生物种类会随纤维水平的提高而增加。章学东等[5]发现饲粮中添加苜蓿草粉会导致蛋鸡肠道菌群结构及多样性发生变异。
近几年来，养鹅业发展迅速，但由于鹅的配合饲料短缺，一些养殖户为追求肉鹅的快速增长，用蛋白质含量较高的鸡、鸭饲料代替鹅饲料，经常引发雏鹅痛风[6]。高蛋白饲粮可致雏鹅发生痛风，而关于不同蛋白质含量的饲粮对雏鹅盲肠微生物菌群的影响鲜见报道。本试验通过饲喂雏鹅蛋白质含量不同的饲粮，利用微生物培养和高通量测序的方法，研究饲粮蛋白质含量对雏鹅盲肠微生物菌群的影响，为调控鹅的健康生长提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验用雁鹅，购自合肥市周边孵化场。
1.2 试验设计与饲养管理试验选用体质量相近的1日龄雏雁鹅72只，根据体质量随机分成A、B和C组，每组3个重复，每个重复8只鹅。A组饲喂粗蛋白质质量分数为16%的基础饲粮，B组饲喂粗蛋白质质量分数为20%的饲粮，C组饲喂粗蛋白质质量分数为24%的饲粮，试验期为14 d。
基础饲粮参照鹅的营养需要[7]，其中粗蛋白质质量分数为16%，在此基础上分别配制粗蛋白质质量分数为20%和24%的2组饲粮，这3种饲粮的能量水平相近。饲粮组成及营养水平见表1。
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表 1 饲粮组成与营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets(Air-dry basis) |
试验在安徽农业大学动物科技学院动物房进行。各组试验鹅分笼饲养，试验期间每天分别于08:00、14:00和21:00喂料。试验鹅自由采食，自由饮水，消毒、卫生防疫和日常管理按照规模化养禽场常规饲养方法进行。
1.3 样品采集试验结束时，每组随机抽取9只鹅，致死后无菌采取盲肠粪便分别放置于2 mL无菌管中，6只用于细菌培养，3只放于液氮中保存，用于高通量测序。
1.4 DNA提取和16S rDNA基因扩增PCR反应用QIAamp DNA Microbiome Kit 试剂盒(Qiagen)抽提鹅盲肠内容物总基因组DNA，用Nanodrop进行DNA浓度检测，采用引物515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')扩增细菌16S rDNA基因V4区。反应条件：94 ℃预变性300 s；94 ℃变性60 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s,循环25次；72 ℃保温600 s。
1.5 高通量测序分析总DNA 提取、PCR 扩增和测序由深圳华大基因科技有限公司协助完成。采用IlluminaHiSeq (IlluminaHiSeq 2500，PE250高通量测序技术)对雏鹅盲肠微生物16S rDNA基因的V4区进行测序。根据样品预扩增结果，将适当的DNA用于PCR反应，加入V6引物和PCR主混合物。用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，然后与末端修复混合物混合，在20 ℃条件下孵育30 min。用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化末端修复的DNA，然后加入A-Tailing Mix，在37 ℃条件下孵育30 min。合并纯化的腺苷酸3'末端DNA。接头和连接混合物，在16 ℃条件下孵育连接反应12~16 h。通过运行25 g/L琼脂糖凝胶约2.5~3.0 h以选择适配器连接的DNA以回收目标片段。用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化凝胶验证文库。文库测序：使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent DNA 1000 Reagents)确定平均分子长度，并通过实时定量PCR(q-PCR)(TaqMan Probe)对文库进行定量。合格的库在cBot上进行放大，以在流通池(TruSeq PE Cluster Kit V3-cBot-HS，Illumina)上生成群集。放大后的流动池通过HiSeq 2500系统(TruSeq SBS KIT-HS V3，Illumina)测序，读取长度90 bp。
1.6 盲肠细菌培养计数用双歧杆菌BS培养基、乳杆菌选择性培养基（LBS琼脂）、麦康凯琼脂培养基分别接种1g盲肠内容物，进行双歧杆菌Bifidobacterium、乳酸杆菌Lactobacillus、大肠埃希菌Escherichia coli和沙门氏菌Salmonella的分离鉴定，取出分离后的菌放入9 mL无菌水中，振荡20 min使微生物细胞分散，静置约20~30 s即成10–1稀释液。再用1 mL无菌吸管吸取10–1稀释液1 mL移入装有9 mL无菌水的试管中吹吸3次，让菌液混合均匀即成10–2稀释液。依此方法倍比稀释成10–3、10–4、10–5、10–6、10–7和10–8等一系列稀释度的菌液供平板计数使用，平板接种培养：根据食品卫生标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在10倍递增稀释的同时，吸取该稀释度稀释液100 μL置于灭菌平皿中，每个稀释度做2个平皿。在平皿注入15 mL凉至46 ℃的营养琼脂培养基，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入含有100 μL无菌稀释液的平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置(36±1) ℃温箱内培养(48±2) h，取出后计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克样品所含菌落总数。
1.7 数据处理对样品进行IlluminaMiSeq双末端测序之后，对微生物群落16S rRNA测序结果进行生物信息学分析，获得Clean data，设置30 bp为窗口长度，移除低于原始read长度75%的reads，去除接头污染reads，去除含N的reads，去除低复杂度reads，通过Illumina平台(Hiseq)进行Paired-end测序。使用软件FLASH 1.2.11进行序列拼接。利用软件USEARCH7.0.1090将拼接好的Tags聚类为操作分类单元(Operational taxonomic unit，OTU)。得到OTU代表序列后，通过RDP classifer 2.2软件将OTU代表序列与数据库序列比对，进行物种注释，置信度阈值设置为0.6，通过QIIME 软件和MOTHER1.31.2软件对OTU进行丰度统计，计算Alpha 多样性，包括Chao1、ACE、Shannon 和Simpson 指数和覆盖率。根据样品OTU数量计算出每个样品的相对丰度，利用丰度信息进行Beta多样性分析，包括OTU的主成分分析(Principle component analysis, PCA)和样品间物种组成聚类分析，通过R 3.1.1软件绘制主成分分析图，通过QIIME 1.80软件，采用迭代算法对样品进行物种聚类[8-9]。
通过统计学的方法检验3组样品间微生物群落丰度的差异，并使用伪发现率(False discovery rate, FDR)评估差异的显著性。从检验结果中筛选出导致3组样品组成差异的物种。分别在门、科和属分类等级进行组间差异显著性分析。微生物计数结果用平均值±标准误表示，采用SPSS 19.0 统计软件中的ANOVA程序进行单因素方差分析，采用Duncan’s法进行多重比较。
2 结果与分析 2.1 盲肠样品测序结果及物种多样性分析 2.1.1 序列及OTU统计从A、B、C 3组雏鹅盲肠样品中共获得1 066 175条高质量的细菌16S rDNA序列，每个样品随机选取的11 846个序列通过质量控制后可用的序列按97%的相似度进行OTU聚类。各样品的OTU数量见表2。
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表 2 雏鹅盲肠样品测序结果 Table 2 Sequencing results of gosling cecal samples |
在97%的相似度下，得到了每个样品的OTU个数，利用Venn图可以展示多样品共有和各自特有OTU数目，根据样品间OTU的重叠情况。结合OTU所代表的物种，可以找出不同环境中的核心微生物。A、B和C组共有OTU数目为1 013个，A、B和C组特有OTU数分别为461、32和75个，A和B组共有OTU 318个，A和C组共有OTU 369个，B与C组共有OTU 246个。
2.1.2 Alpha多样性分析Alpha多样性结果见表3。各组覆盖率均大于0.999，说明了该测序结果已基本覆盖样本的多样性，本试验数据具有有效性。Alpha多样性分析显示A组OTU数量、Chaol指数、ACE指数均显著高于B、C组，B组和C组间无显著差异，说明A组物种多样性与B、C组有显著差异。
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表 3 雏鹅盲肠样品微生物的Alpha多样性分析1) Table 3 Alpha diversity analysis of microorganisms in gosling cecal samples |
PCA分析是将多个变量通过线性变换以选出较少个数重要变量的一种多元统计分析方法。通过分析不同样品OTU组成可以反映样品的差异和距离，如果两个样品距离越近，则表示这两个样品的组成越相似。
根据各个样品OTU 的种类及其丰度计算各个样品间的加权UniFrac距离，并基于此，对样品进行了PCA分析，结果如图1所示，PC1对检测到的总微生物的代表性贡献率为46.64%，PC2贡献率为16.46%。3个组9个样品能够较明显分开，A组明显与B、C组分开，B组和C组之间也分开，说明饲喂同一蛋白质质量分数的饲粮，体内微生物菌群组成相似。
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图 1 雏鹅盲肠样品基于微生物OTU丰度的主成分分析 Fig. 1 Principal component analysis of gosling cecal samples based on OTU abundance of microorganisms 坐标轴上括号中的百分数表示该主成分对样品差异的贡献率；图中圆点表示各个样品。红、蓝和绿色代表样品分属于A、B和C组 The percentage in parenthesis on the coordinate axis indicated the contribution rate of the principal component to the sample difference; The points in the figure represented each sample. Red, blue and green colors represented samples belonging to groups A, B and C respectively |
由图2可以看出，A组的A1、A2、A3共聚为一类，B组和C组聚为一类。说明饲喂不同蛋白质含量的饲粮，雏鹅体内微生物群落组成不同，超过营养需求蛋白质，肠道微生物群落组成聚类不明显。
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图 2 雏鹅盲肠样品聚类分析 Fig. 2 Clustering analysis of gosling cecal samples |
在门水平上雏鹅盲肠微生物丰度数据见表4。雏鹅粪便中的9大优势菌门分别是放线菌Actinobacteria、拟杆菌Bacteroidetes、厚壁菌门Firmicutes、蓝藻门Cyanobacteria、脱铁杆菌Deferribacteres、广古菌门Euryarchaeota、变形菌门Proteobacteria、疣微菌门Verrucomicrobia和TM7，占菌群分类的98%以上，其余1%左右的为其他未被分类的菌门。A组放线菌门、蓝藻门、脱铁杆菌门和TM7显著高于B、C组，B组拟杆菌门显著高于A、C组，厚壁菌门虽差异不显著，但A组仍高于B、C组。说明饲料中添加过高水平的蛋白质可以使雏鹅盲肠微生物菌门发生变化。
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表 4 雏鹅盲肠微生物在门、科和属水平的物种丰度1) Table 4 Species abundance of gosling cecal microbes at phylum, family and genus levels |
在科水平上雏鹅肠道微生物丰度数据见表4。雏鹅粪便中的9大优势菌科分别是拟杆菌科Bacteroidaceae、梭菌科Clostridiaceae、脱硫弧菌科Desulfovibrionaceae、肠杆菌科Enterobacteriaceae、毛螺菌科Lachnospiraceae、乳杆菌科Lactobacillaceae、理研菌科Rikenellaceae、疣微菌科Ruminococcaceae和韦荣球菌科Veillonellaceae，其中A组梭菌科、肠杆菌科、疣微菌科和韦荣球菌科均显著高于B、C组，B和C组的毛螺菌科显著高于A组，C组的理研菌科显著高于A、B组。A组的拟杆菌科和乳杆菌科大于B、C组，但无显著差异；A组脱硫弧菌科小于B、C组，但无显著差异。
2.3.3 14日龄雏鹅属水平上盲肠微生物丰度由表4可知，雏鹅盲肠粪便中的微生物在属水平上的12种优势菌属为气球菌属Aerococcus、拟杆菌属Bacteroides、劳特氏菌属Blautia、梭菌属Clostridium、Gallicola、乳酸菌属Lactococcus、巨单胞菌属Megamonas、理研菌属Rikenella、罗斯氏菌属Rothia、小球菌属Subdoligranulum、萨特菌属Sutterella和Turicibacter。A组的气球菌属、Gallicola、乳酸菌属、巨单胞菌属、罗斯氏菌属和Turicibacter显著高于B、C组，理研菌属显著低于B、C组，C组的梭菌属和小球菌属显著高于A、B组，B组的拟杆菌属、萨特菌属和劳特氏菌属显著高于A、C组。
2.4 雏鹅盲肠内双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希菌和沙门氏菌数量由表5可知，C组双歧杆菌的数量显著低于A、B组，B组双歧杆菌数量低于A组，但无显著差异。A、B、C 3组乳酸杆菌的数量依次减少，但无显著差异。C组大肠埃希菌和沙门氏菌数量显著高于A、B组，B组大肠埃希菌和沙门氏菌数量高于A组，但差异不显著。
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表 5 雏鹅盲肠内双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希菌和沙门氏菌数量1) Table 5 Numbers of Bifidobacteria, Lactobacilli, Escherichia coli and Salmonella in gosling cecum |
近年来，高通量测序技术被广泛应用于各个领域，张莉力等[10]利用高通量测序技术比较散养和笼养2种饲养方式下12、18周龄大骨鸡盲肠微生物组成差异，肖英平等[11]采用高通量测序技术分析饲料中添加丁酸梭菌对肉鸡盲肠菌群结构的影响。本试验从A、B、C 3组14日龄雏鹅盲肠样品中共获得1 066 175条高质量的细菌16S rDNA序列，每个样品随机选取的11 846个序列通过质量控制后可用的序列按97%的相似度进行OTU聚类，基于OTUs的注释结果显示，9个样品合并的总体样品共获得1 031个OTU。比较各组Alpha多样性指数，各组覆盖率均大于0.99，说明该测序结果已基本覆盖样本的多样性，本试验数据具有有效性。Alpha多样性分析中，Chaol指数、ACE指数、Shannon指数随着饲粮中蛋白质含量的增加而增加，Simpon指数随着饲粮中蛋白质含量的增加而减少。这说明随着饲粮中蛋白质含量的增加，雏鹅盲肠内微生物群落多样性在减少，这与Mu等[12]的研究结果一致。
3.2 饲粮蛋白质含量对14日龄雏鹅盲肠微生物群落结构的影响通过高通量测序技术发现，在门水平上的优势菌门为放线菌、拟杆菌、厚壁菌门、变形菌门、疣微菌门等。其中，A组放线菌门和TM7的物种丰度显著高于B、C组，B组拟杆菌门的物种丰度显著高于A、C组。Norouzi等[13]认为放线菌具有抗多种耐药(MDR)病原体生物活性，是一种潜在的益生菌。本试验A组放线菌门的物种丰度大于B、C组，说明高蛋白饲粮降低了有益菌丰度；拟杆菌门包括三大类细菌，即拟杆菌纲、黄杆菌纲和鞘脂杆菌纲，很多拟杆菌纲的种类生活在人或者动物的肠道中，有些时候成为病原菌。从本试验结果可以看出，饲喂蛋白质质量分数为20%的饲粮可使拟杆菌门细菌丰度增加；TM7被称为微生物暗物质，许多作用机制还尚不明确[14]，有试验证明，TM7存在时，巨噬细胞中的TNF-α诱导受到抑制，从而抑制了体内的免疫作用[15]。本试验A组TM7显著高于B、C组，这可能与TM7的免疫抑制作用有关。厚壁菌门也是肠道内的有益菌门，虽然各组差异不显著，但A组仍高于B、C组。
在科水平上的优势菌群主要是拟杆菌科、梭菌科、脱硫弧菌科、肠杆菌科、毛螺菌科、乳杆菌科、理研菌科、疣微菌科和韦荣球菌科，其中A组梭菌科、肠杆菌科、疣微菌科和韦荣球菌科物种丰度均显著高于B、C组，说明在正常饲养条件下，梭菌科、肠杆菌科、疣微菌科和韦荣球菌科在雏鹅盲肠内发挥着重要作用。有研究显示，草食动物肠道内的毛螺旋科、纤维杆菌属等细菌与其食草特性相关[16]，毛螺旋科菌群的主要作用是降解植物饲料细胞壁中的果胶、果糖、纤维二糖等，产生挥发性脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸等)，为动物及肠道微生物提供能量，还有部分毛螺菌科属于真菌性致病菌。本试验B组和C组的毛螺菌科丰度显著高于A组，各组饲料中纤维素水平相同，表明饲喂高蛋白饲粮增加了盲肠内真菌性致病菌的数量，从而增加发生疾病的概率。
雏鹅盲肠粪便粪中的微生物在属水平上的优势菌为艾克曼菌属、拟杆菌属、棒状杆菌、乳酸菌属。本试验A组的气球菌属、Gallicola、乳酸菌属、巨单胞菌属、罗斯氏菌属和Turicibacter的丰度显著高于B、C组，这与本试验细菌培养计数结果相一致，进一步表明饲喂高蛋白饲粮可以使雏鹅盲肠内的乳酸杆菌数量降低；同时，使气球菌属、Gallicola、巨单胞菌属、罗斯氏菌属和Turicibacter等有益菌属的丰度减少。
3.3 饲粮蛋白质含量对14日龄雏鹅盲肠双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希菌和沙门氏菌数量的影响本研究发现饲喂高蛋白质饲粮可使雏鹅盲肠内的双歧杆菌和乳酸杆菌数量减少，而大肠埃希菌和沙门氏菌数量增加，说明饲喂高蛋白饲粮可使雏鹅盲肠内微生物发生变化。有研究表明，双歧杆菌定植在动物肠道中能起到生物屏障、营养、免疫增强作用，并改善胃肠道功能[17]，乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢和细菌素，或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌，通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能，从而保护肠道[18]。大肠埃希菌和沙门氏菌是禽类肠道常见的致病菌[19]。
3.4 结论饲喂高蛋白饲粮使雏鹅盲肠微生物菌群多样性发生变化，菌群丰度降低；同时，饲喂高蛋白饲粮可以使雏鹅盲肠内双歧杆菌和乳酸杆菌等有益菌数量减少，大肠埃希菌和沙门氏菌数量增加。
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