2. 江苏恒丰强生物技术有限公司,江苏 南通 226100
2. Jiangsu Hengfengqiang Biotechnology Co., Ltd., Nantong 226100, China
猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是单股正链RNA病毒,有囊膜,直径在50~70 nm,全基因组1.5 kb左右[1-3]。PRRSV是猪繁殖与呼吸道综合征(PRRS)的主要病原,PRRS是一种在世界范围内广泛存在的烈性传染病,对全球养猪业造成了重大危害。1987年首次在美国被发现,之后在加拿大及其他北美地区出现。2006年夏季由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly Pathogenic PRRSV, HP-PRRSV)引起的“无名高热”综合征,相较2006年之前的毒株可引起仔猪的高发病率与高死亡率,给我国养猪业带来了沉重的经济损失[4-6]。感染猪通常会产生免疫抑制,从而继发感染其他细菌和病毒。临床表现主要有两方面:一是母猪严重的繁殖障碍,包括流产死胎、木乃伊胎及弱仔;二是各年龄段猪感染后均出现呼吸系统症状,常伴随非特异性的间质性肺炎[7]。
福建地处沿海,生猪产业发展迅速。在全国生猪优势区域布局规划中,福建确定为我国生猪产业的优势区域布局和发展重点区域,在生猪产业中具有生产基础、市场竞争、产品加工等优势,与此同时福建也是我国的生猪主销区之一,养猪业的健康发展对福建省的经济发展起着重要的作用[8]。PRRSV新现毒株与国内经典毒株的重组导致出现新的高致病性PRRSV,这让我国PRRS的防治工作更是雪上加霜[9]。在福建地区陆续有PRRSV新毒株的出现,如NADC30-like和欧洲I型毒株[10-11],尤其NADC30-like毒株,已有研究证明现有商业化蓝耳病疫苗不能对其提供完全保护[12]。近年来福建省陆续出台相关政策,对畜禽养殖要求提高门槛,同时将大力支持可养区生猪养殖场实施标准化改造[13-14]。这种趋势有助于提升猪场生物安全防控能力,对于猪场疫病防控起到一定的促进作用。
中小型养猪场与大型规模化、标准化养猪场相比,因其规模小、设施和管理相对比较落后、生物安全措施较薄弱,往往是疫病高发区。通过有针对性地对福建地区各中小型养猪场进行PRRSV流行病学调查,有助于了解PRRSV在该地区的流行情况,为PRRSV的防控提供借鉴。因PRRSV的GP5蛋白是诱导产生中和抗体的主要结构蛋白,编码GP5蛋白的ORF5基因在一定程度上能反映PRRSV的遗传变异情况,所以本试验主要是以GP5蛋白的流行程度来反映PRRSV的流行情况。
1 材料与方法 1.1 样品收集2017年83份疑似感染PRRSV的病料收集于福建龙岩、南平、漳州、福州、宁德等县市各中小型猪场。样品类型包括猪肺脏、淋巴结等,其中龙岩地区收集了12份,南平21份,漳州17份,福州9份,泉州5份,三明15份,宁德4份。将采集的组织样品研磨并于–70 ℃条件下保存,由国家生猪种业工程技术研究中心实验室留存。
1.2 主要试剂RNA抽提试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司,RNA酶抑制剂、dNTP混合物(2.5 mmol/L)、TaKaRa ExTaq DNA聚合酶、DNA Marker DL 2 000和克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司;DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司;感受态细胞大肠埃希菌DH5α购自北京天根生化科技有限公司。
1.3 引物设计与合成根据 GenBank中收录的JXA1的基因序列(EF112445.1)与国内外流行的PRRSV毒株基因序列的比对结果,设计2套扩增PRRSVORF5基因的引物,引物序列见表 1。
取–70 ℃保存备用的病料处理上清液,按上海飞捷生物技术有限公司的RNA抽提试剂盒操作说明书提取病毒RNA,用适量RNase free水溶解,–20 ℃条件下保存备用。
1.5 RT-PCR 扩增以20 μL为反转体系,分别加入制备好的RNA 9.5 μL,5×MLV Buffer 4.0 μL,MLV反转录酶 1.0 μL,dNTPs (2.5 mmol/L) 4.0 μL,RNase Inhibitor (20 U/μL) 0.5 μL,反转录随机引物1.0 μL,混匀后,置于恒温水浴锅中42 ℃反应1 h后获得 cDNA 模板。将cDNA用于 PCR 反应。采用50 μLPCR体系,分别加入TaKaRa Ex -Taq DNA聚合酶25 μL,cDNA模板2 μL,上下游引物(20 pmol/μL)各2 μL,加ddH2O至终体系50 μL。反应参数:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s (ORF5片段为1 min),共30个循环;最后72 ℃延伸10 min。反应结束后,用10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察。
1.6 ORF5基因的克隆和测序参照DNA Purification Kit说明书回收扩增的目的片段后,于16 ℃将目的基因与pMD18-T载体过夜连接,连接产物转化到 DH5a感受态细胞,37 ℃条件下倒置培养10~16 h,挑菌,经PCR鉴定为阳性的菌液送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行序列测定。
1.7 ORF5基因的进化树以及GP5蛋白的氨基酸序列分析将各片段的测序结果,利用DNAStarLasergne软件进行人工拼接,得到PRRSV ORF5基因序列。从GenBank已上传毒株序列中选择具有代表性的26株PRRSV毒株,其中1株欧洲毒株,7株美国毒株和18株中国毒株。用MEGA6.0软件进行遗传进化树的绘制,用DNA Star 7.0软件进行氨基酸序列相似性的比较。
2 结果与分析 2.1 2017年福建地区PRRSV样品检测结果2017年在福建南平、宁德、三明、漳州、福州、泉州、龙岩等地区70个中小规模猪场采集83份疑似蓝耳阳性样品,阳性检出率为73%(置信度为95.0%,置信区间为62.1%~82.2%),在NCBI上比对GP5遗传进化树显示分离毒株仍以JXA1亚群为主,占61%,GM2为代表毒株的分支检出率为17%,出现新的分支占15%,NADC30分支毒株占7%。南平、宁德、三明、福州、龙岩、泉州和漳州市的阳性率分别为26.50%、9.56%、15.47%、11.45%、12.58%、8.38%和17.76%。
2.2 PRRSV GP5氨基酸序列分析比较不同PRRSV毒株的氨基酸序列,结果如图1所示。GP5各个区域的功能依次为信号肽区1~26 aa、诱导表位[27A(I/V)VLV29]、主要中和表位[37 H(F/L)QLIYNL45]、高变区、转膜区以及细胞表位,毒力相关位点为R13和 R151[15-16]。本试验NADC30为参考毒株亚群,以R13Q为主,其他分离株亚群以R13为主,仅有2株R13H突变,而R151氨基酸位点在各个分离株亚群中不变,以JXA1毒株为参考毒株的第I亚群和第II亚群出现了广泛的位点突变,包括信号肽区(L14S、F16S、A26T)、诱导表位(L28P、V29A),高变区1 (S32N、N33Q)和高变区2 (A28N/K)等突变位点,在细胞表位功能区的突变与其他亚群基本保持一致。GM2亚群大部分毒株与参考毒株相比在主要中和表位发生了H28Y和L29S突变,同时新出现的亚群与其他亚群相比在信号肽区(C10Y、L17S)、诱导表位区(A21V)、高变区1(N23T/A D24S)、主要中和表位(L41S)和高变区2(A57V)等具有特征性的位点,在其他位点仅少数存在氨基酸置换。通过糖基化分析预测,不同亚群糖基化位点也存在着一定的差异,JXA1亚群I有4个糖基化位点,亚群II只有3个,GM2和NADC30据推测也只有3个糖基化位点,新出现的亚群存在4个糖基化位点。
GeneBank上选取PRRSV的参考毒株与2017年测得的序列进行遗传进化分析,结果如图2所示,所有毒株均属于美洲型毒株,与参考毒株划分为不同的亚群,其中以JXA1毒株为代表的高致病性亚群仍为主要检出毒株,并与以往不同的是进化为2个不同的分支。以GM2为代表毒株的分支检出7株,且有新的进化分支形成。有3株分布在NADC30毒株为代表的分支上。经典株 CH-1a、美洲型疫苗株VR2332 和高致病性与经典毒株过渡株亚群未检出。其中共有6株毒株分布于新出现的分支中,与以往国内报道的毒株不同。
ORF5的核苷酸序列分析显示,ORF5的核苷酸序列相似性达80.3%~100.0%,通过遗传进化树可以看到,各分支毒株与其所属分支的代表毒株NADC30、GM2 和JXA1的核苷酸序列相似性分别为92.6%~93.9%、89.8%~93.0%和 93.4%~99.3%。其中新出现的分支与CH-1a、JXA1和GM2的核苷酸序列相似性分别为91.7%~92.1%、92.4%~93.0%和81.9%~82.2%。在遗传进化树上独立形成分支的毒株 FJNP-LRX-04与以上参考毒株相比核苷酸序列相似性为82.7.%~87.2%,其中相似性最高的参考毒株是JXA1,相似性为87.2%。
3 讨论与结论本试验采集了福建地区几个市县PRRSV疑似蓝耳阳性病料,且收集了来源于福建地区中小规模养殖场的病料,所以本次试验覆盖地区广,有一定的代表性。福建地区送检猪场阳性率为73%,根据ORF5基因遗传进化分析显示,福建地区的毒株具有多样性,分布在5个大的分支上,检出以JXA1亚群为主,且分化呈两大分支的形式存在。以GM2为代表的lineage 3分支毒株在多地猪场都有检出,该支系毒株90年代最早出现在中国香港和台湾。有研究表明:GM2毒株在一些猪场长期存在,并且有不断扩大流行的趋势[17-18]。通过临床观察和统计,流行GM2毒株的猪场怀孕母猪流产率在10%左右,仔猪临床表现以高热为主,死亡率在10%~25%之间。以类NADC30为参考毒株的亚群检出率为7%,推测可能类NADC30毒株在福建地区尚未成为流行毒株。
通过遗传进化分析显示,新出现的毒株亚群分支的GP5氨基酸位点出现了一些新的特征,这些氨基酸变化在其他亚群中没有出现,其对毒株的生物学特征的影响需要进一步试验验证。该类型毒株分布于福建部分县市猪场,且没有呈现明显的地域特征。其中检测到FJNP-LRX-04等新毒株与流行参考毒株JXA1 ORF5基因序列相似性为92%~93%,是否会成为流行毒株需要进一步研究。病毒囊膜上的糖基化位点,会屏蔽相关的抗原表位,造成免疫逃逸[19],以JXA1为代表的高致病性毒株存在4个糖基化位点,而新出现的分支亚群也有同样特点,所以可能会出现对现有疫苗免疫逃逸。
本研究通过对福建地区中小规模猪场PRRSV的分子检测及ORF5基因的变异分析,初步了解了福建地区中小规模猪场PRRSV毒株流行情况,并且对引种或跨区域传播引起的风险提供了一定的参考。
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