2019, Vol. 40
牛结核病主要是由牛分枝杆菌Mycobacterium bovis引起的一种人兽共患病[1]，影响范围非常广泛，涉及大多数的哺乳动物宿主，包括人类、牛、鹿、骆驼、猪、猫等，值得注意的是牛分枝杆菌对野生动物和杂食动物的威胁同样严重。有报道，马[2-3]和羊[4-5]对结核病具有较高的耐受性。
发展中国家牛结核病的危害要远甚于发达国家。在缺乏有效措施和力度控制牛结核病的国家和地区，形势非常严峻。研究报道中10个欧盟国家大约60例的年度病例总数和拉丁美洲估计7 000例的病理报告充分说明了这一问题[6-7]。
结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶A(Protein tyrosine phosphatase，PtpA)是分枝杆菌中一个重要的磷酸化酶，启动子的表达只发生在生长缓慢的卡介苗细菌中，在快速增长的腐生类耻垢分枝杆菌中不表达[8]。PtpA基因是致病性分枝杆菌基因组中具有重要调控作用的一段基因，可通过和利用宿主NF-κB信号通路竞争结合宿主衔接蛋白TAB3，进一步发挥对宿主先天免疫应答的抑制作用，进而帮助结核分枝杆菌逃避宿主免疫系统的清除作用[9-10]。牛分枝杆菌在基因上虽然与结核分枝杆菌区别极小，但对宿主的致病机制却大为不同，对于牛分枝杆菌PtpA基因是如何通过NF-κB信号通路逃避宿主免疫系统清除作用的机制，是否和结核分枝杆菌PtpA基因相似，目前还不清楚。本研究旨在说明牛分枝杆菌PtpA蛋白是如何通过调控NF-κB信号通路来逃避宿主免疫系统清除作用的机制。
1 材料与方法 1.1 DNA、细胞、质粒牛分枝杆菌基因组DNA、人肾上皮细胞(HEK293T)、真核表达载体p3×FLAG-CMV-10、PEGFP-N1由华南农业大学兽医学院临床外科实验室保存；克隆载体pMD-18T Vector购自宝生物工程(大连)有限公司；pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]报告基因质粒购自美国Promega公司
1.2 主要试剂和仪器试剂：EX(Taq)酶试剂盒、核酸染料、DL2000 DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；限制性内切酶Not I、Xba I、T4连接酶购自NEB公司；2×Taq PCR Star Mix购自Genstar公司；琼脂糖购自Biowest公司；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、快速质粒小提试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒、IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG(H+L)购自LI-COR公司；溴化乙锭(EB)替代物购自广州晖鼎生物科技有限公司；SDS-PAGE试剂盒购自杭州弗德生物公司；预染蛋白Marker、转染试剂LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent购自Thermo公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜，0.45 μm)购自GE公司；脱脂奶粉购自广州华奇盛生物科技有限公司；逆转录产品HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、ChamQ TM Universal SYBR® qPCR Master Mix购自南京诺维赞生物技术公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司、通用型总RNA抽提试剂盒购自广州东盛生物技术有限公司。
仪器：电泳成像系统(香港基因有限公司)、核酸电泳仪(美国BIO-RAD)、SDS-PAGE垂直电泳槽(美国BIO-RAD)、全能型蛋白转印系统(美国BIO-RAD)、恒温金属浴(北京天根生化科技有限公司)、LightCycler 480荧光定量PCR仪(罗氏(Roche)公司)。
1.3 引物设计与合成根据NCBI公布的牛分枝杆菌PtpA全长基因和人源NF-κB信号通路相关细胞因子的基因序列设计引物(表1)。相关细胞因子包括：白细胞介素6(Interleukin-6，IL-6)、粒细胞−巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、细胞凋亡抑制蛋白1(Cellular inhibitor of apoptosis 1，cIAP1又称BIRC-2)、细胞凋亡抑制蛋白2(Cellular inhibitor of apoptosis 2，cIAP2又称BIRC-3)。
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表 1 引物名称及序列 Table 1 Primer name and sequence |
以牛分枝杆菌基因组DNA为模板，利用所设计的引物，进行PCR扩增。PCR反应采用50 μL反应体系，含5 U/μL的EX Taq 0.5 μL、引物FLAG-PtpA-F 2 μL、引物FLAG-PtpA-R 2 μL (序列见表1)、2.5 mmol/L的dNTP Mixture 8 μL、Template DNA 2 μL、ddH2O 35.5 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终延伸5 min，4 ℃保存。预计扩增的目的片段大小为492 bp。PCR反应结束后，经15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。获得带有NotⅠ、Xba I酶切位点的PtpA全长基因。
1.5 构建重组真核表达质粒对PCR产物进行纯化回收，将回收产物与p3×FLAG-CMV-10真核表达载体进行双酶切后，在T4 DNA连接酶的作用下于16 ℃金属浴过夜连接，将连接产物转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞，扩菌提取重组质粒后进行测序，重组质粒命名为FLAG-PtpA。
1.6 检测重组质粒在细胞中的表达培养HEK293T细胞至汇合度约75%，使用转染试剂LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent将测序结果完全正确的重组质粒转入细胞，转染48 h后，收集细胞提取总蛋白，进行Western blot检测。
1.7 双荧光素酶报告基因检测通过共转pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro] Vector和FLAG-PtpA质粒，以10 ng/mL的TNF-α刺激细胞激活NF-κB信号通路后，观察PtpA蛋白对NF-κB信号通路激活作用的影响，试验设置对照组，分别于0、2、4、8、12、24和48 h用双荧光素酶检测试剂盒进行检测，通过对比萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的相对荧光强度的比值确定NF-κB信号通路的激活情况，确定PtpA蛋白对NF-κB信号通路激活的作用。
荧光定量PCR(qPCR)检测细胞因子的表达量
HEK293T细胞培养后进行转染：一组不做处理，另一组转染FLAG-PtpA质粒。分别于0、2、4、8、12、24、48和72 h收集细胞，根据通用型总RNA抽提试剂盒说明书提取总RNA，按照逆转录产品HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行cDNA的制备。以不同时间点样本的cDNA为模板，分别使用所设计的5组引物(序列见表1)同步进行扩增反应(每个样本引物均设置3个重复孔)，每个浓度梯度设置3个重复孔，设置阴性对照。根据ChamQTM Universal SYBR® qPCR Master Mix通用型qPCR预混液说明书配制反应体系及设置反应程序(需避光)，使用罗氏公司Roche Lightcycler 480系统进行qPCR，反应结束后根据Roche Lightcycler 480系统操作说明进行数据处理。使用2−ΔΔCt法[11]，计算分析不同细胞因子的mRNA相对表达量。
1.9 数据分析双荧光素酶试验和qPCR试验数据利用GraphPad Prism 5.0软件进行分析和图表绘制，采用t检验法进行差异显著性分析。
2 结果与分析 2.1 PtpA基因的扩增及重组表达载体的构建将PtpA基因进行PCR扩增后得到492 bp的基因片段，与预期片段大小一致(图1)，将带有酶切位点的PtpA基因和p3×FLAG-CMV-10真核表达载体双酶切成功构建FLAG-PtpA重组质粒后，用p3×FLAG-CMV-10真核表达载体通用引物进行PCR扩增，得到约750 bp的片段(图2)，进行测序，测序结果与NCBI上公布的序列一致(Gene ID：887373)。
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图 1 PtpA基因的PCR扩增 Fig. 1 PCR amplification of the PtpA gene 1：PtpA基因的PCR扩增产物；M：DL2000 DNA marker；2：阴性对照 1: PCR product of PtpA gene; M: DL2000 DNA marker;2: Negative control |
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图 2 FLAG-PtpA重组质粒中PtpA基因的PCR扩增 Fig. 2 PCR amplification of PtpA gene in FLAG-PtpA recombinant plasmid 1：阴性对照；M：DL2000 DNA marker；2：PtpA基因的PCR扩增产物 1: Negative control; M: DL2000 DNA marker; 2: PCR product of PtpA gene |
培养HEK293T细胞至汇合度约75%，使用转染试剂LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent对细胞进行脂质体转染。细胞分为转染组和非转染组。由于FLAG-PtpA载体质粒在细胞中表达的蛋白无荧光，无法简单而直接地判断质粒是否转入细胞，而增强型荧光蛋白报告基因质粒(pEGFP-N1)在细胞中表达的蛋白带有绿色荧光，可以直接在荧光显微镜下观察到，因此转染组共转染FLAG-PtpA载体质粒和pEGFP-N1质粒可以确定转染效率，非转染组不做任何处理。由图3的转染结果可以发现转染组转染效率约为50%。
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图 3 真核表达载体转染293T细胞 Fig. 3 Eukaryotic expression vector transfected 293T cells A1：293T未转染质粒(白镜)；A2：293T未转染质粒(荧光)；B1：293T转染FLAG-PtpA载体质粒+pEGFP-N1质粒(白镜)；B2：293T转染FLAG-PtpA载体质粒+pEGFP-N1质粒(荧光) A1: 293T untransfected plasmid (white mirror); A2: 293T untransfected plasmid (fluorescent); B1: 293T transfected FLAG-PtpA plasmid and pEGFP-N1 plasmid (white mirror); B2: 293T transfected FLAG-PtpA plasmid and pEGFP-N1 plasmid (fluorescence) |
转染的细胞提取总蛋白用SDS-PAGE检测，发现在相对分子质量为22 000处可见特异性蛋白条带(图4)。之后以抗FLAG标签的抗体为一抗，对表达产物进行Western blot检测，结果显示，表达产物可与一抗特异性结合，证明该蛋白是PtpA蛋白(图5)，表明FLAG-PtpA重组质粒在HEK293T细胞中成功表达。
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图 4 HEK293T细胞中FLAG-PtpA表达产物鉴定 Fig. 4 Identification of FLAG-PtpA expression product in HEK293T cells M：低相对分子质量蛋白质标准；1:空白对照；2：HEK293T细胞中转染p3×FLAG-CMV-10质粒；3：HEK293T细胞中转染FLAG-PtpA质粒 M: Low molecular weight protein standard; 1: Blank control; 2: p3×FLAG-CMV-10 plasmid transfected into HEK293T cells; 3: FLAG-PtpA plasmid transfected into HEK293T cells |
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图 5 HEK293T表达FLAG-PtpA蛋白特异性分析 Fig. 5 HEK293T expression FLAG-PtpA protein specificity analysis M：低相对分子质量蛋白质标准；1：HEK293T表达的FLAG-PtpA蛋白 M: Low molecular weight protein standard; 1: FLAG-PtpA protein expressed by HEK293T |
转染后细胞分不同时间点收集后经检测发现，转染2 h后，对照组萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的相对荧光强度比值是试验组的2.93倍，差异显著(P<0.05)。转染4~24 h后，试验组与对照组相比差异极显著(P<0.01)，说明转染PtpA表达质粒与否对NF-κB信号通路的激活具有显著影响，PtpA蛋白对NF-κB信号通路的激活具有显著的抑制作用，特别在信号通路激活早期的影响更为明显(图6)。
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图 6 PtpA蛋白对NF-κB信号通路激活的影响 Fig. 6 Effect of PtpA protein on activation of NF-κB signaling pathway “*”、“**”和“***”分别表示差异达到0.05、0.01和0.001的显著水平(t检验) “*”, “**” and “***” indicate the difference reaches 0.05, 0.01 and 0.001 significance levels respectively (t test) |
荧光定量结果经使用2−ΔΔCt法分析，计算不同细胞因子的mRNA相对表达量。利用分析软件Graphpad prism 5.0分析每个时间点试验组与对照组数据P值，结果显示，对照组IL-6、GM-CSF、BIRC-2和BIRC-3的表达量在转染2 h后分别是试验组的3.93、3.42、2.17和2.30倍；在转染4 h后分别是试验组的4.26、3.93、2.36和2.50倍。在转染2 h和4 h后，IL-6、GM-CSF、BIRC-2、BIRC-3的表达量与对照组相比都差异极显著(P<0.01)(图7)，说明PtpA蛋白对上述NF-κB信号通路相关的细胞因子在免疫早期具有显著抑制作用。这也与之前PtpA蛋白对NF-κB信号通路激活影响的研究结果一致。
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图 7 细胞因子的mRNA表达量 Fig. 7 mRNA expression of cell factors “*”、“**”和“***”分别表示差异达到0.05、0.01和 0.001的显著水平(t检验) “*”，“**” and “***” indicate the difference reaches 0.05，0.01 and 0.001 significance levels respectively (t test) |
蛋白酪氨酸磷酸酶是从蛋白质上的磷酸化酪氨酸残基去除磷酸基团的一组酶。蛋白酪氨酸磷酸化是一种常见的翻译后修饰，可以为蛋白质相互作用和细胞定位产生新的识别基序，影响蛋白质稳定性并调节酶活性。维持蛋白酪氨酸磷酸化的适当水平对许多细胞功能是必不可少的[12]。使用半胱氨酰−磷酸酶中间体，酪氨酸特异性蛋白磷酸酶催化去除与酪氨酸残基连接的磷酸基团。这些酶是信号转导途径(例如MAP激酶途径)和细胞周期控制中的关键调节组分，并且在控制细胞生长、增殖、分化、转化和突触可塑性中发挥重要调控作用[13-16]。在结核杆菌感染宿主后，牛分枝杆菌PtpA基因的去磷酸化为结核杆菌逃避宿主免疫清除发挥着重要作用[17-18]。
本研究构建了FLAG-PtpA重组质粒，通过双荧光素酶报告系统对PtpA蛋白对NF-κB信号通路的具体作用做了初步探索。pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]载体是信号通路报告载体和哺乳动物载体，含有5个NF-κB应答原件，可以驱动荧光素酶报告基因luc2P的表达，分析NF-κB信号通路是否激活。试验结果表明，PtpA蛋白对NF-κB信号通路的激活具有显著的抑制作用，特别在信号通路激活早期的影响更为显著。这一结果与前人报道[19-20]的结果相符合：结核分枝杆菌在感染机体后通过分泌一些蛋白来抑制宿主免疫应答，从而逃避宿主清除作用后藏匿于细胞内，在机体免疫能力降低后表现出致病力。本研究结果提示牛分枝杆菌PtpA蛋白可能在宿主感染病原菌后机体免疫应答早期抑制相关免疫应答信号通路的激活，从而帮助结核分枝杆菌逃避宿主免疫系统清除，使结核杆菌能够藏匿于机体细胞内。
本研究采用qPCR的方法继续探究了PtpA蛋白对NF-κB信号通路相关细胞因子表达量的影响，以进一步确定PtpA蛋白对NF-κB信号通路具体调控机制。结果表明，PtpA蛋白对NF-κB信号通路相关的细胞因子在免疫早期具有显著抑制作用，这一结果提示PtpA蛋白在调控宿主先天免疫应答作用上主要集中在免疫应答早期，这一结果与PtpA蛋白对NF-κB信号通路激活的影响结果一致。
目前对于结核病的防控研究已迫在眉睫，而现在所常用的检测及免疫手段都有着不可控的缺陷，对于结核病防控的研究来说，找到一种有效的治疗药物或者免疫药物是未来的研究方向。本研究以分枝杆菌一个重要磷酸化酶PtpA蛋白为目标，通过研究该蛋白对应答免疫相关的重要信号通路NF-κB信号通路的影响，揭示了PtpA蛋白在机体应答免疫中所发挥的具体作用，为后续研究有效的结核病防控药物提供了理论基础。
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