2019, Vol. 40
2. 广西大学 生命科学与技术学院，广西 南宁 530004;
3. 广西大学 亚热带生物资源保护与利用国家重点实验室，广西 南宁 530004
2. College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China;
3. State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, Guangxi University, Nanning 530004, China
水稻Oryza sativa是我国重要的粮食作物之一，在水稻种植过程中肥料的施加是必不可少的[1]。其中氮素在植物生长发育中具有不可替代的作用，氮素参与植物叶绿素、维生素、能量等的合成[2]，氮素的多少直接影响植物的生长发育。提高氮肥的利用效率可以在一定程度上减少氮肥的施加，同时也可减少因过量施加氮肥对水源、土壤、大气环境等造成的危害[3]。耐低氮的水稻品种可以在氮素较低的条件下，提高自身对氮素的利用效率，维持自身的正常生长，减少水稻对氮肥的依赖性，改善因过量施加氮肥所造成的环境危害，因此水稻耐低氮基因的研究变得尤为重要。
植物耐低氮的遗传机制较为复杂，可能受到多个不同途径的基因调控。OsAMT1.4与OsAMT5基因的克隆揭示了氨转运蛋白在NH4+吸收和转运过程中的重要性[4]；DEP1编码与磷脂酰乙醇胺结合蛋白有类似功能域的蛋白，调控水稻产量性状并影响氮素的利用效率，提高水稻在低氮条件下的耐受能力[5]；转录因子Dof1通过影响植物的氮素同化过程来改善植物在低氮环境下对氮素的利用效率，增加体内氮素含量，促进生长[6]。研究者们在水稻耐低氮的研究方面做了大量工作，定位了许多与低氮胁迫相关的数量性状位点(QTL)，Shan等[7]利用‘珍汕97A’与‘明恢63’杂交构建的重组自交系作为材料，在水稻6号染色体定位到1个与氮素利用率相关的QTL位点；王彦荣等[8]利用kasalath/koshihikari重组自交系群体在6、7、8、9号染色体上定位到10个与耐低氮相关性状位点；方萍等[9]利用重组自交系群体，在第2、5、6、12号染色体上检测到5个与氮素吸收效率相关的QTL位点。但多数研究以重组自交系为材料，QTL效应分析易受背景干扰，为了避免这种情况，本研究采用染色体单片段代换系作为试验材料，可以大大减少或者清除背景片段的影响。而且不需要复杂的统计分析，基因定位更加可靠。同时为了模拟低氮环境，本研究以水培的方式进行处理，通过在水稻完全培养液中减少氮素的含量来达到低氮的目的。水培培养可以满足水稻在苗期的正常生长发育，此法简单易行，利于变量的控制，不受季节影响，重复性强。
本研究以Koshihikari (受体)和Nona Bokra (供体)构建的染色体单片段代换系SN群体作为材料，进行低氮处理，定位与水稻苗期耐低氮相关性状的QTL，以期为以后水稻苗期耐低氮相关性状的QTL精细定位、图位克隆以及功能研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料以Koshihikari (下文用Koshi表示)为父本，Nona Bokra (下文用Nona表示)为母本经过多次回交并配合分子标记辅助选择构建的染色体单片段代换系SN群体为材料，该SN群体材料由中国科学院上海植物生理生态研究所林鸿宣院士馈赠。其中Koshi为轮回亲本，Nona为供体亲本，代换系SN群体包含154个株系。
1.2 水稻培养和低氮处理取SN群体各株系及亲本饱满的种子100粒，放于含有滤纸的培养皿中，采用30 g/L的H2O2溶液消毒10 min，蒸馏水冲洗3~4次，然后加入适量的蒸馏水置于30 ℃恒温培养箱中进行暗培养。培养3 d后选取发芽一致的种子40粒，移栽到96孔塑料板中，并将板放于避光的杯型容器上，在容器中加入适量的蒸馏水淹没种子，放于温室中培养。幼苗生长3~5 d后，将蒸馏水更换为水稻完全培养液，水稻完全培养液的配制参照国际水稻所配方[10], 每3 d更换1次完全培养液。待幼苗长到三叶期时(30 d)，首先进行亲本低氮差异耐受浓度的筛选，以水稻完全培养液中的氮素含量为标准(以NH4NO3质量浓度计算)，正常水平的NH4NO3质量浓度为80.00 mg/L。在正常水平下进行10、100、200和500倍稀释来模拟低氮环境，分别对应于8.00、0.80、0.40和0.16 mg/L的NH4NO3。通过对亲本在不同低氮水平下的表型分析，计算各个表型的相对变化值(处理组/对照组)，寻找合适的低氮处理浓度。待低氮处理浓度确定后，SN群体在该低氮浓度下进行处理，每3 d更换1次低氮培养液，在处理14 d后停止培养，取每个株系的对照组和处理组各3株长势相当的幼苗，测量每株的株高、根长、茎叶鲜质量和根鲜质量，然后将苗和根放入称量瓶中，做好标记，放入电热恒温干燥箱中，110 ℃杀青30 min，80 ℃烘干4 d，恒质量后，称量茎叶干质量和根干质量。考虑到不同水稻品种生长差异，本研究以相对损失比来进行统计分析，并按照公式计算相对损失比：相对损失比=1−(处理组/对照组)。以上试验均在广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室温室内进行。
1.3 水稻表型统计分析利用Excel 2010软件对低氮处理前后的相关表型进行统计分析，运用IBM SPSS Statistics 23软件对不同表型与低氮浓度的相关性进行分析，采用LSD法对2个亲本不同表型在不同低氮浓度下的统计数据进行组内多重比较，同一浓度数据进行组间student t检验。
1.4 构建遗传连锁图谱将统计的表型与SN群体的基因型导入到QTL IciMapping 4.1.0[11]中，运用QTL mapping in CSS lines算法进行QTL分析。根据排列测验Permutations=1 000，P=0.001，确定选取LOD值≥2.5作为检测QTL的阈值，计算出QTL的加性效应和可解释的表型变异范围。QTL命名遵循McCouch等[12]的原则。利用Mapchart 2.3软件进行染色体遗传图谱构建。
2 结果与分析 2.1 亲本低氮差异耐受浓度的筛选为了寻找适合的低氮浓度，本研究将氮浓度分为5个水平。在不同低氮浓度下，Koshi与Nona表型相比于对照组出现了一定的差异性(图1)。通过对不同氮素浓度与表型的相关性分析(表1)，发现2个亲本的根长、茎叶鲜质量、茎叶干质量、总鲜质量都表现出与氮素浓度极显著相关。除此之外，Koshi的株高、根鲜质量、根干质量、总干质量与氮素浓度也表现出极显著相关，而Nona的相应表型变化则与氮素浓度不相关，可能Nona在株高、根鲜质量、根干质量、总干质量表型方面受低氮影响较弱或不受其影响。当水稻培养液中NH4NO3质量浓度为0.4 mg/L时，Nona在相对根长、茎叶鲜质量、根鲜质量、根干质量、总鲜质量、总干质量等6个表型相比Koshi显著增加。Nona表现出较强的适应能力，各表型相比对照组变化较小，低氮耐受能力较强，而Koshi则受低氮影响较大，5个表型相比对照组显著降低(图2)。因此，选取含有0.4 mg/L NH4NO3的水稻低氮培养液用于SN群体处理，进行下一步耐低氮QTL分析。
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表 1 亲本表型与氮素浓度相关性分析 Table 1 Correlation analysis between parental phenotype and nitrogen level |
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图 2 亲本合适低氮浓度筛选 Fig. 2 Selection of suitable low nitrogen level for parents 各图中，相同颜色柱子上方的不同的小写字母表示Koshi或Nona组内差异显著(P<0.05, LSD法)；“*” 和 “**”分别表示同一NH4NO3质量浓度的Koshi与Nona组间差异达到0.05和0.01的显著水平(t检验) In each figure, different lowercase letters on bars of the same color indicate significant difference in Koshi or Nona group (P<0.05, LSD method); “*” and “**” represent significant difference between Koshi and Nona groups of the same NH4NO3 content at 0.05 and 0.01 levels respectively (t test) |
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图 1 亲本对照组与低氮处理组表型 Fig. 1 Parental phenotypes of low nitrogen treatment (0.4 mg/L NH4NO3) and control groups |
SN群体在低氮(0.4 mg/L NH4NO3)处理后，各株系在株高、根长、根鲜质量、根干质量、茎叶鲜质量、茎叶干质量、总鲜质量、总干质量等8个表型均存在差异(图3)。其中，低氮处理后多数株系在株高、茎叶鲜质量、茎叶干质量等方面出现明显下降，相对损失量较多，在茎叶鲜质量、茎叶干质量两种表型中则有极少数株系呈现增长趋势(图3C、3E)，如株系43(相对茎叶鲜质量损失比−0.187，相对茎叶干质量损失比−0.453)等，相比对照组有所增加；而根长、根鲜质量、根干质量等表型在低氮胁迫后多数株系呈现增长趋势，在根长、根干质量与根鲜质量3个表型中少数株系相比对照组损失量较多(图3B、3D、3F)，如株系87(相对根长损失比0.407，相对根干质量损失比0.506，相对根鲜质量损失比0.714)、88(相对根长损失比0.352，相对根干质量损失比0.378，相对根鲜质量损失比0.615)等，可能在这2个株系中存在与根部低氮敏感相关基因，而株系43(相对根长损失比−0.706，相对根干质量损失比−2.791，相对根鲜质量损失比−3.950)、44(相对根长损失比−0.615，相对根干质量损失比−1.298，相对根鲜质量损失比−1.057)在低氮条件下相比对照组增加量较多；多数株系总鲜质量以及总干质量在低氮胁迫后出现下降趋势，总鲜质量表型中只有极少数株系相对增长(图3G)，如株系43(相对总鲜质量损失比−0.650)、39(相对总鲜质量损失比−0.232)等，而总干质量表型中有近1/3株系相比对照组有所增加(图3H)。综合以上群体表型分析，发现在低氮条件下株系43的茎叶鲜质量(相对损失比−0.187)、茎叶干质量(相对损失比−0.453)、根长(相对损失比−0.706)、根鲜质量(相对损失比−3.950)、根干质量(相对损失比−2.791)、总鲜质量(相对损失比−0.650)、总干质量(相对损失比−0.760)等7个表型相比对照组都有增长趋势，表现出较强的低氮耐受能力；而株系87(相对株高损失比0.363，相对根长损失比0.407，相对茎叶鲜质量损失比0.736，相对茎叶干质量损失比0.623，相对根鲜质量损失比0.714，相对根干质量损失比0.506，相对总鲜质量损失比0.730，相对总干质量损失比0.595)、88(相对株高损失比0.276，相对根长损失比0.352，相对茎叶鲜质量损失比0.678，相对茎叶干质量损失比0.508，相对根鲜质量损失比0.615，相对根干质量损失比0.378，相对总鲜质量损失比0.665，相对总干质量损失比0.478)的8个表型均相比对照组有较多损失，表现出低氮敏感表型(图4)。其他株系在不同的表型相比对照组表现出不同的增加或损失，一些根长、根鲜质量、根干质量增加的株系在总鲜质量与总干质量表型中也表现出增长趋势，如株系34、43、44等，但这些株系中只有少数在茎叶鲜质量、茎叶干质量中表现出增长趋势，可能在低氮条件下根部的增长只能满足极少数株系茎叶对养分的需求，而大多数株系则不能满足，导致多数株系茎叶鲜质量、茎叶干质量的减少；大部分茎叶鲜质量、茎叶干质量增加的株系在总鲜质量与总干质量表型中表现出增长趋势，如株系25、39、43等，这些株系在根鲜质量、根干质量表型中也表现出相应的增长趋势；多数根鲜质量、茎叶鲜质量损失较多的株系在根干质量、茎叶干质量、总鲜质量、总干质量也表现出较多损失，如株系80、87、88、104等，在低氮条件下根部与茎叶的鲜质量损失会影响整个植株的生长情况；总鲜质量、总干质量增加的株系在茎叶鲜质量、茎叶干质量表型中也表现出增长趋势，如株系25、39、43、149等，但在根鲜质量、根干质量表型中只有少数株系出现增长趋势，如株系39、43等，而在总鲜质量、总干质量损失较多的株系中，大多数株系在其他6个表型中均出现较多损失。低氮胁迫后株系中多个表型出现相似的变化趋势，各表型变幅与变异系数调整到可接受范围内(表2)，为接下来的QTL分析提供一定基础。
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图 3 SN群体在低氮胁迫下不同表型值的损失比 Fig. 3 The loss ratios of different phenotypes under low nitrogen stress among SN population 图中紫色部分为SN群体表型损失比，蓝色部分为误差线 The purple part in figure is the phenotypic loss ratio of SN group, and the blue part is the error bar |
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图 4 株系43、87在低氮胁迫下的处理组与对照组表型 Fig. 4 Phenotypes of line 43 and line 87 of the treatment and control groups under low nitrogen stress |
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表 2 低氮胁迫下SN代换系群体表型分析 Table 2 Analysis of the phenotypes in the chromosomal segment substitution lines of SN population under low nitrogen stress |
以相对损失比作为指标，对8个相关表型进行QTL分析，共定位到2个与低氮胁迫相关的位点，分别位于1号染色体和2号染色体(图5)。其中1个与根长相关耐低氮位点(qRL1-1)定位于1号染色体M1-29引物附近，LOD值为2.89，可解释的表型变异为11.23%，加性效应值为负数，等位基因来源于亲本Koshi。另一个与根鲜质量相关耐低氮位点(qRFW2-1)定位于2号染色体M2-225引物附近，LOD值为2.53，可解释的表型变异为9.90%，加性效应值为负数，等位基因来源于亲本Koshi(表3)。其他6个表型低氮处理后的相对损失比QTL分析，未检测到耐低氮相关位点。
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图 5 QTL在水稻染色体上的位置 Fig. 5 Location of QTL mapped on rice chromosome |
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表 3 低氮胁迫相关性状的QTL位点分析 Table 3 Analysis of QTL identified trait related to low nitrogen tolerance |
氮元素参与水稻叶绿素和体内多种酶的合成，其含量的多少对水稻生长发育以及产量具有重要意义[13]。目前随着人口的增长，人们对水稻产量需求也相应提高，而提高水稻产量则需要增加肥料的施加，其中最主要是氮肥[14]。但大量使用氮肥会降低肥料的利用率，同时也会对水源、土壤、大气环境造成严重危害，因此选育耐低氮的水稻品种在经济效益和环境效益上都具有非常重要的意义。水稻耐低氮基因研究已经成了这个时代许多农学科研工作者的研究内容，但传统育种周期太长且变异方向不明确，将分子辅助育种与传统育种相结合，可大大提高耐低氮品种的育种效率，选育出耐低氮型水稻新品种。
QTL定位是进行遗传分析的有效方式[15]，也是培育耐低氮水稻品种的理论基础。目前有关水稻耐低氮QTL定位的报道已有很多，其中多数研究者采用不同的栽培方法进行试验，主要以大田法和盆栽法为主。大田法提供的水稻生长环境与田间土壤条件基本一致[16]，在自然条件下进行田间筛选有利于获得更准确的数据，但周期长，工作量大，耗费资源，不能进行大批量的筛选。同时土壤肥力较难控制，易受降雨量及气温等气候因素影响，数据重复性较差。盆栽法有利于对氮素含量的控制，规模小，周期较短，调查方便。但盆栽的生长环境与田间土壤条件存在一定差异，不能真实地反映水稻受到低氮胁迫后的生长情况。本次研究采用的是水培的方式进行试验，其最大的优点是可以对培养介质进行准确有效的控制，能对某些形态或生理指标进行快速筛选，并且培养条件可以准确无误地进行重复[17]，但水培条件与田间土壤有着本质的区别，水培只适用于初步筛选，进一步的确认仍需要在田间进行。总之，各个筛选方法之间各有优缺点，要根据实验室条件、试验目的、筛选指标、筛选时期等因素来确定合适的筛选方法。
本研究结合实验室条件与筛选工作量等因素决定采用水培的方式进行筛选，以染色体单片段代换系作为QTL定位材料，在苗期进行低氮处理。统计分析后定位到2个与低氮胁迫相关的基因区域，其中一个与根长相关耐低氮位点定位于1号染色体，贡献率为11.23%；另一个与根鲜质量相关耐低氮位点定位于2号染色体，贡献率为9.90%。根是水稻吸收水分和无机盐的重要组织[18]，根长以及根鲜质量在受到低氮胁迫后的变化可作为水稻耐低氮的参照。抗性植株在受到低氮胁迫后，其根长与根鲜质量相比正常条件下会增长，利于寻找和吸收相对较多的氮素，提高氮素的利用效率，维持植株的营养生长以及生殖生长[19]。其他6个表型未检测到耐低氮相关位点，可能在这些性状中参与耐低氮的基因是由多个微效基因组成，单个基因贡献率较低，导致无法检测到。在赵春芳等[20]的研究中，定位到一个位于2号染色体与株高相关的耐低氮位点，与本研究中根鲜质量耐低氮位点相近，可能在此区域内存在一个或多个调控水稻不同性状的耐低氮位点。并且在前人的研究中[16, 20-22]，1号与2号染色体中存在较多的耐低氮相关位点，说明这2个染色体与低氮胁迫相关性较高，在今后的研究中可以着重关注。本研究对根长、根鲜质量相关耐低氮位点的定位，可为以后基因的精细定位与克隆提供试验依据，同时也为耐低氮育种提供一定理论依据，加快育种进程。
致谢：非常感谢中国科学院上海植物生理生态研究所林鸿宣院士馈赠SN群体材料！
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