玉米螟Ostrinia furnacalis和黏虫Mythinna separata是我国玉米Zea may主产区最主要的害虫^[1]。据统计，玉米螟一般发生年可造成减产7%~10%，轻者可造成减产5%左右，重者造成减产达20%~30%，甚至更多^[2-3]。目前玉米螟和黏虫等虫害主要采用化学农药防治，虽然具有一定功效，但同时也带来诸多问题，如农药的使用破坏了生态环境，增加了农业生产成本，化学农药在食物中的残留危害人类的身体健康，长期使用农药带来害虫耐药性，致使害虫防治更困难。而通过培育抗虫性品种来防治虫害，经济有效^[4-6]。

以重组DNA和转基因技术为重点的生物技术的快速发展，为培育抗虫玉米新品种提供了新的手段^[7-9]。与传统的育种方法相比，转基因育种技术具有虫害防治成本低、抗性基因来源丰富、不受不同生物体间生殖隔离的限制等优点^[10-12]。但受基因型限制，适合于遗传转化的受体材料有限，转化率低，且通过遗传转化获得的自交系植株的综合性状通常不优良，因此较为简便的是通过回交的方法将目的基因导入到综合农艺性状优良的背景材料中，从而获得既具有优良的外源目的基因性状，又具有综合优良性状的品种^[13-15]。本研究对回交转育的Bt材料进行转基因检测和遗传特性研究。通过玉米螟、黏虫受害情况调查，结合分子鉴定，对种植的转Bt基因材料进行筛选，为转基因抗虫研究提供材料和参考。

1 材料与方法 1.1 供试材料

供试材料由吉林农业大学农学院种子科学与工程教研室提供。

2016年，以Reid群骨干系PH6WC及其育成的自交系J1490、J1495、4DH10和外引系PH1CPS作母本，以Non-Reid为基础的转Bt基因材料6DH85、J1401和6DH222以及自选系J9D207、J1628、J1668为父本，按NCⅡ遗传交配设计，组配30 (5×6)个杂交组合。2017年春，将30个杂交组合和11个亲本以及对照材料先玉335(CK)在吉林大学“转基因实验圃”作随机区组处理，2次重复，4行区，行长5 m。种植密度6.0万株/hm²。2017年冬，以同样的方法将补充的亲本(8DH273和8DH279)和组配的杂交种及原有的材料在海南实验田种植。2016和2017年共计组配40个杂交组合。

1.2 抗虫鉴定调查

田间抗虫鉴定：在不施用任何药剂情况下分别于苗期、腊熟期调查玉米植株受玉米螟和黏虫的为害程度，参照农业部953号公告—10.1—2007标准^[16]确定食叶级别和雌穗被害级别，从而确定转基因抗虫玉米的抗性水平。

室内抗虫鉴定：采取转基因和未转基因幼嫩玉米叶片饲喂玉米螟，每个处理饲喂10头，饲喂3 d后称质量1次。

1.3 小区产量测定及室内考种

每小区选取中间2行收获，风干脱粒，测量小区产量及测定含水量，转换成标准水分的产量。选取10个果穗进行室内考种。包括穗长、穗粗、穗轴粗、秃尖长、穗行数、行粒数、百粒质量、穗粒质量、穗质量等性状。

1.4 Bt基因检测

分子鉴定参照文献[17]的方法。利用复合式PCR方法对转Bt基因玉米进行鉴定，建立总反应体系为25 μL的PCR反应体系。具体操作：DNA首先在99 ℃下预变性5 min，经过3步(95 ℃变性5 s，65 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min)40轮循环后，终延伸72 ℃ 5 min，之后在4℃保温。在25 μL总反应体积中，含有10×PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/L Mg²⁺ 2.0 μL，DMSO 1.25 μL，5 U/μL Taq酶0.20 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，20 ng/μL DNA 2.5 μL，ddH₂O补齐25 μL。所用的引物分别为XTPNT(5′- CAGGTCGCTGTCATTGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3′，5′- CAGGTCGCTGTCAATAATTGCGGGACTCTAAC-3′)和XTPCM(5′- CAGGTGGCAGTCATCATTGCGATAAAGGAAAGC-3′，5′- CAGGTGGCAGTCACGAAGCATAGTCGGATTGTG-3′)，引物序列的下划线部分为人为加入富含GC的片段，PCR产物用12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。

1.5 数据分析

应用Excel软件整理试验数据，用DPS软件^[18]进行方差分析和Tukey法多重比较。

杂种优势分析按平均优势和对照优势进行^[19]。

平均优势=100%( ${{\overline{{{F}}}}_1} - {\overline{{\rm{MP}}}})/{\overline{{\rm{MP}}}}$ ，式中 ${{\overline{{{F}}}}_1}$ 为杂种1代某性状均值， ${\overline{{\rm{MP}}}}$ 为双亲某性状平均值。

对照优势=100%( ${{\overline{{{F}}}}_1} - {\overline{{\rm{CK}}}})/{\overline{{\rm{CK}}}}$ ，式中 ${\overline{{\rm{CK}}}}$ 为对照品种某一性状均值。

2 结果与分析 2.1 转Bt基因自交系及其杂交种检测

对5份回交转育的转基因材料6DH85、J1401、6DH222、8DH273和8DH279进行分子检测，电泳结果表明，在大约100 bp处，出现了与阳性对照大小完全一致的DNA片段，表明外源Bt基因可以通过杂交和连续自交导入自交系中，5份转基因材料中J1401、8DH273和8DH279呈阳性(图1)。

对由J1401、8DH273和8DH279组配的15个杂交组合包括J1495×J1401、J1490×J1401、4DH10×J1401、PH1CPS×J1401、PH6WC×J1401、PH6WC×8DH273、J1490×8DH273、J1495×8DH273、PH1CPS×8DH273、4DH10×8DH273、PH6WC×8DH279、J1490×8DH279、J1495×8DH279、PH1CPS×8DH279和4DH10×8DH279进行转Bt基因检测，结果如图2所示，其中组合J1495×J1401、PH6WC×8DH273、J1490×8DH273、J1495×8DH273、PH1CPS×8DH273、4DH10×8DH273、PH6WC×8DH279、J1490×8DH279、J1495×8DH279、PH1CPS×8DH279、4DH10×8DH279呈阳性。通过对回交转育材料及其组配杂交种的Bt基因检测，发现通过回交后代处理的系谱法获得的转基因后代出现转基因丢失或者沉默，因此需进行转基因跟踪检测。

2.2 组合及自交系抗虫表现 2.2.1 田间抗虫表现

对5份转基因材料6DH85、J1401、6DH222、8DH273、8DH279和2份骨干系PH6WC、J9D207，以及由J1401、8DH273、8DH279组配的15个杂交组合的田间抗虫表现进行了鉴定。结果如表1所示，苗期叶片被害级别以J1401、8DH273、8DH279自交系和组合J1495×J1401、PH6WC×8DH273、J1490×8DH273、J1495×8DH273、PH1CPS×8DH273、4DH10×8DH273、PH6WC×8DH279、J1490×8DH279、J1495×8DH279、PH1CPS×8DH279、4DH10×8DH279为高抗，茎秆折断率各组合均为0；腊熟期雌穗被害级别同样是J1401、8DH273、8DH279自交系和组合J1495×J1401、PH6WC×8DH273、J1490×8DH273、J1495×8DH273、PH1CPS×8DH273、4DH10×8DH273、PH6WC×8DH279、J1490×8DH279、J1495×8DH279、PH1CPS×8DH279、4DH10×8DH279为高抗，茎秆折断率均为0。由此表明，通过回交转育法获得的转Bt基因自交系可在玉米各时期表现抗虫性。

2.2.2 室内抗虫表现

对5份转基因材料6DH85、J1401、6DH222、8DH273、8DH279和2份骨干系PH6WC、J9D207，以及由J1401、8DH273、8DH279所组配的15个杂交组合的室内抗虫表现进行了鉴定。结果如表2所示，以不含Bt基因植株的叶片饲喂玉米螟，其成长较快，而以含有Bt基因植株的叶片饲喂玉米螟时，低龄幼虫较快死亡，高龄幼虫虽然不会死亡，但是生长缓慢。由此表明，通过回交转育法获得的转Bt基因自交系的抗虫性表现明显。

2.3 产量及其构成因素方差分析

将40个杂交组合的穗长、穗粗、秃尖长、穗质量、百粒质量及产量性状的方差分析列于表3，6个性状F值均达到极显著水平，表明所组配的杂交组合遗传差异普遍存在。

2.4 不同组合的产量比较

将40个杂交组合中产量高于对照先玉335的组合产量数据归纳于表4。从表4可以看出，含有Bt基因的组合增产效果较其他组合明显，其中组合4DH10×8DH279比对照品种先玉335最高增产31.10%，差异达极显著水平，而组合J1495×J1401虽然含有Bt基因，与其同父本组合相比增产效果明显，最高可增产65.77%，但与先玉335相比，仅增产10.04%，说明仅靠抗虫这一单一手段不能从根本上解决粮食产量问题。

2.5 杂种优势分析

40个杂交组合产量性状的杂种优势如表5所示。结合转Bt基因检测结果发现，以转Bt基因8DH273、8DH279为父本组配的10个组合的平均优势及对照优势(或超标优势)均表现较好，其中，组合PH6WC×8DH279、4DH10×8DH273和J1490×8DH279的对照优势最高，分别为28.45%、26.48%和24.75%；以转Bt基因J1401为父本组配的5个组合中，只有含Bt基因的组合J1495×J1401的平均优势及对照优势均表现较好，平均优势为125.60%，对照优势(或超标优势)达11.27%，而其他不含Bt基因4个组合的平均优势及对照优势却表现很差，说明含有转Bt基因玉米的产量可以明显提高，也说明了经回交转育但未表达的改良材料，产量降低很多。同样，经转育未表达的6DH85和6DH222，除个别杂交组合优势较高外，总体表现较差。

3 讨论与结论

转Bt基因后代材料在苗期对黏虫、腊熟期对玉米螟的田间抗虫性以及室内抗虫鉴定表现都比较突出，均为高抗，说明通过回交转育法获得的转Bt基因自交系可在玉米生长各时期表现抗虫性，这与朱卫红等^[20]、李余良等^[21]研究相一致。通过PCR试验对亲本验证，亲本J1401、8DH273和8DH279含有Bt基因，说明通过杂交的方法可以将Bt基因转入到自交系中，对其组配的杂交组合通过PCR试验进行验证，结果显示杂交组合J1495×J1401、PH6WC×8DH273、J1490×8DH273、J1495×8DH273、PH1CPS×8DH273、4DH10×8DH273、PH6WC×8DH279、J1490×8DH279、J1495×8DH279、PH1CPS×8DH279、4DH10×8DH279含有Bt基因，而其他组合均不含有Bt基因，说明在培育转基因抗虫植株时，经过几代有性繁殖后可发生外源基因沉默或者丢失的现象，从而影响其应用价值，这与刘清等^[22]的研究结果相同。因此在研究转基因植株时需进行基因跟踪检测。

含有Bt基因组合表现为明显的对照优势，与对照品种先玉335相比，组合4DH10×8DH279表现最好，增产31.10%，产量明显提高，其增产来自转Bt基因对虫害的抗性效应，这与罗梅浩等^[23]研究结果相同。亲本J9D207虽然不含有Bt基因，但其组配的杂交组合的产量与对照品种先玉335相比提高产量20.39%，而组合J1495×J1401虽然也含有Bt基因，与先玉335相比，仅增产10.04%，说明仅靠抗虫这一单一手段不能从根本上解决粮食产量问题，因此分子转基因育种应结合常规育种手段，才有望培育出高产、抗虫、优质的玉米品种^[24-26]。