2019, Vol. 40
随着水产养殖品种的增多和养殖规模的扩大，各种传染性疾病不断暴发和流行，已成为制约水产养殖业健康可持续发展的主要瓶颈。虹彩病毒(Iridovirus)是目前海水和淡水养殖鱼类最严重的病毒性病原之一，在世界各地已从100多种鱼类中分离鉴定出虹彩病毒[1]。虹彩病毒是一类具正二十面体的双链大DNA病毒，直径为125~380 nm，基因组140~303 kb。目前虹彩病毒科Iridoviridae分为2个亚科5个属，即感染鱼类、两栖和爬行动物的虹彩病毒α亚科，包括蛙病毒属Ranavirus、肿大细胞病毒属Megalocytivirus、淋巴囊肿病毒属Lymphocystivirus，以及感染无脊椎动物的虹彩病毒β亚科，包括虹彩病毒属Iridovirus和绿虹彩病毒属Chloriridovirus[2]。其中蛙病毒属成员是近年来在鱼类、两栖类和爬行类等低等水生脊椎动物中严重暴发和流行的病毒性病原，不仅严重威胁水生脊椎动物的多样性和生态安全，而且给水产养殖业造成重大经济损失。石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGIV)是从新加坡患病的石斑鱼中分离鉴定出的高致病性虹彩病毒，2017年出版的第10版国际病毒分类手册中把SGIV正式确定为蛙病毒属的1个新种[2]。SGIV极易感染中国和东南亚等国家和地区养殖的石斑鱼等海水鱼类。本文系统全面地综述了近年在SGIV分离鉴定、形态结构与复制装配、组学研究与功能基因分析、感染致病的细胞基础、宿主抗病毒免疫功能基因分析、分子检测和免疫防控技术等方面的研究进展。
1 SGIV的分离鉴定、形态结构和复制装配 1.1 建立对SGIV敏感的海水鱼类新细胞系病毒作为简单的生物体不能自由存活，必须依赖宿主细胞进行复制和繁殖。鱼类细胞培养是进行鱼类病毒分离增殖，进而研究病毒致病机理、病毒宿主相互作用以及研制疫苗的基础。1962年Wolf和Quimby建立了世界上第1个鱼类细胞系，截止2019年5月已建立至少200种鱼类细胞系。但是，仅少部分鱼类细胞系提交到美国典型培养物收藏库(ATCC)等国际性细胞收藏中心。提交的这些细胞系大多来源于传统的淡水鱼类，而对暴发和流行的重要海水鱼类病毒如虹彩病毒和神经坏死症病毒不敏感。近年来，根据海水鱼类的生理特点，通过改进培养基配方和摸索合适的培养条件，已自主建立10多种海水鱼类组织的永久细胞系，包括来源于石斑鱼脾、肾脏、肝脏、脑、鳔和尖吻鲈胚胎、卵形鲳鲹尾鳍、卵形鲳鲹脑及卵形鲳鲹头肾等组织的细胞系[3-9]。上述细胞系对虹彩病毒、神经坏死症病毒和弹状病毒等多种新型鱼类病毒敏感，已在国内外广泛应用于海水鱼类病毒的分离培养、病毒–宿主相互作用、海洋生物功能基因分析及疫苗开发和药物筛选等研究。
1.2 SGIV的分离鉴定1994年，新加坡、印尼和马来西亚等东南亚国家养殖的石斑鱼暴发了一种类似于虹彩病毒病的严重传染性疾病，称为昏睡石斑鱼病(Sleepy grouper disease, SGD)。但采用当时现有的细胞系并没有分离出病毒，对病原缺乏相应的生化和分子生物学分析和鉴定。1998年，当类似的疾病再次暴发流行时，利用自主建立的细胞系，从患病石斑鱼Epinephelus tauvina脾脏中成功分离出病毒。该病毒感染力很强，在1周内造成石斑鱼的死亡率可达90%以上。生理、生化、分子生物学和基因测序结果表明，该石斑鱼病毒与虹彩病毒科蛙病毒属的模式种——蛙病毒3型(Frogvirus3，FV3)较接近，其主要衣壳蛋白在DNA和氨基酸水平的序列相似性分别为70%和69%。根据病毒的分子分类学原则，研究者认为这是一种新的病毒，并将其定名为SGIV(Singpore grouper iridovirus，SGIV)[10-11]。目前，SGIV已得到国际病毒分类委员会的确认，在第10版国际病毒分类手册中被列为虹彩病毒科蛙病毒属的1个新种[2]。
1.3 SGIV的形态结构及在宿主细胞内的复制和装配在SGIV−敏感细胞模型建立的基础上，应用电镜技术结合生化分析研究SGIV的形态、超微结构及其在细胞中的复制和装配过程。SGIV存在于宿主细胞质中，为正二十面体，直径介于154~176 nm，双层膜包围着一个93 nm的电子致密核，其核衣壳亚单位约为5 nm。纯化的细胞外病毒颗粒具有3层膜结构，包括最外层的脂蛋白囊膜，中间层为具有规律排列的蛋白质衣壳，最内层为脂质膜。在电子显微镜下，初次观察到虹彩病毒粒子在细胞内发生和复制的各个阶段(图1)。病毒粒子首先吸附在宿主的细胞膜上，通过内吞噬作用进入细胞质中，被内吞入细胞的细胞质膜形成球形包围着病毒，病毒囊膜逐渐与细胞质膜融合并向外扩张，把细胞核推挤向一边并导致细胞核变形，从而在细胞中央形成一个巨大的病毒包涵体。在包涵体内可观察到大量病毒粒子复制和组装的不同阶段。同时，电镜观察结果揭示了虹彩病毒特有的自组装过程，病毒的核酸−蛋白质复合体核物质首先进入部分形成的开放式核衣壳中，然后开放式核衣壳封闭形成完整的病毒核衣壳，病毒核衣壳获得由宿主细胞质膜来源的囊膜包被，以出芽方式释放到细胞外，开始下一轮感染和复制[10](图1e~图1g)。
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图 1 SGIV病毒的分离、纯化及细胞内的复制增殖[3, 10-11] Fig. 1 Isolation and purification of SGIV and its replication in cells a：患病石斑鱼肿大的脾脏；b：正常的石斑鱼脾细胞；c：SGIV感染引起脾细胞明显的细胞病变；d：感染细胞的超微结果观察，VM：病毒装配区，EC：空衣壳，MC：成熟核衣壳，NU：细胞核，标尺1 μm；e~g分别表示SGIV病毒粒子的出芽、释放及重感染邻近细胞，标尺为100 nm a: The enlarged spleen of diseased grouper; b: Mock grouper spleen cells; c: The cytopathic effects induced by SGIV infection; d: Ultrastructural observation of infected cells, VM: viromatrix, EC: empty capsid, MC: matured nucleocapsid, NU: nuclesus, scale bar is 1 μm; e~g indicate budding, release and reinfection of SGIV particles respectively, scale bars are 100 nm |
通过基因组、蛋白质组和转录组等技术全面开展SGIV的病原分子生物学特征分析。率先完成SGIV的全基因组序列测定(登录号 AY521625)。SGIV基因组为140 kb的双链DNA，包含162个开放阅读框(Open reading frame, ORF)，分别编码41~1 268个氨基酸的蛋白质。其中，超过一半的ORF(85个)为未知基因。
蛋白质组学研究分析鉴定到29个编码病毒蛋白的基因，发现与致病和抗原等有关的20个新病毒基因[12]。同时，通过Triton X-100处理纯病毒采用SDS-PAGE成功分离病毒囊膜和核衣壳。应用SDS-PAGE结合MALDI-TOF-MS/MS(1-DE-MALDI-TOF-MS/MS)技术成功分离并鉴定9个SGIV的囊膜蛋白，而应用LC-MALDI-TOF-MS/MS技术鉴定出19个病毒囊膜蛋白。其中，用2种技术均鉴定出4个病毒基因(ORF 016L、ORF 019R、ORF 088L和ORF 039L)编码的囊膜蛋白。随后，通过免疫胶体金电镜等技术进一步验证了019R、088L和039L为病毒的囊膜蛋白[13-15]。有趣的是在病毒囊膜成分中还鉴定到5个宿主编码的蛋白，包括病毒诱导胁迫蛋白、类似核糖体结合蛋白、离子通道蛋白、发动蛋白和类似血影蛋白，推测这些蛋白可能是整合于病毒囊膜的宿主蛋白，在病毒感染细胞、内吞以及组装等过程中起重要作用[13]。
在SGIV病毒的转录组学研究方面，制备了包含SGIV所有ORF的全基因组基因芯片，并运用基因芯片技术完成SGIV体外感染石斑鱼脾细胞(GS)和体内感染石斑鱼脾组织的转录图谱，初步界定出SGIV 的3类不同表达时相的转录本。SGIV基因在体内体外感染过程中的转录模式有很大的差异，SGIV在体外感染GS细胞中，共有15个立即早期(Immediate early, IE)、89个早期(Early, E)和53个晚期(Late, L)转录本。SGIV在体内感染的转录模式更为复杂，宿主可能主要通过抑制与病毒复制有关的IE和E期转录本来破坏病毒的复制机制，从而产生免疫清除效应[16]。
为揭示SGIV在其感染过程中是否编码miRNA，将感染了SGIV不同时期的石斑鱼胚胎细胞混合后构建小RNA库，通过Illumina/Solexa深度测序，共得到34 400个病毒来源小RNAs，经过一系列生物信息学分析鉴定出16个SGIV编码的miRNAs。其中SGIV-miR-homoHSV与HSV-2 miR-H4-5p序列相似度较高，提示miRNAs在远源病毒种中比较保守。SGIV miRNAs分散分布于基因组中，在其3′端或5′端存在序列或长度的异质性。茎环实时量荧光−PCR及荧光素酶报告基因试验证实，其中11个miRNAs在SGIV感染的细胞中有表达，且具有生物学活性[17]。
2.2 SGIV的功能基因组学研究 2.2.1 IE基因IE基因的转录出现在病毒DNA复制之前，可以对病毒基因和宿主细胞基因的表达进行调控，并能够影响宿主细胞周期、细胞凋亡和细胞免疫反应。生物信息学分析及转录组学分析推测ORF086R(ICP18)和ORF162L(ICP46)为SGIV的2个IE基因。利用放线菌酮和阿糖胞苷进行的药物抑制试验证实了ICP18和ICP46为IE基因。ICP18和ICP46分别为SGIV核衣壳蛋白和新的病毒结构蛋白。由于病毒感染细胞中2个病毒蛋白的相对分子质量与推定的相对分子质量有差异，推测在感染过程中产生了一定的修饰。亚细胞定位观察结果表明，ICP18和ICP46为胞质型蛋白。过表达ICP18和ICP46均能促进细胞的生长和SGIV的增殖，表明SGIV的IE基因可能通过调控细胞的生长而促进病毒复制[18-19]。
2.2.2 囊膜蛋白囊膜在病毒侵染致病过程中发挥着重要作用，对囊膜蛋白的深入研究有利于发现与阐明虹彩病毒囊膜蛋白的生物学功能，并为病毒防治提供理论依据。在SGIV囊膜蛋白质组学研究的基础上，对部分SGIV的囊膜蛋白进行了验证和功能分析。SGIV VP88是虹彩病毒科1个保守的病毒蛋白，该蛋白具有跨膜结构、糖蛋白修饰、精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸序列(Arg-Gly-Asp, RGD)结构域。VP88存在于病毒囊膜组分中，并定位于病毒囊膜上，证明VP88为SGIV的囊膜蛋白。此外，黏附试验表明，VP88黏附于细胞表面，且VP88重组蛋白能够竞争性抑制病毒感染宿主细胞，推测其可能具有介导病毒黏附宿主细胞的功能[13]。
囊膜蛋白组学研究结果也表明，SGIV VP19可能为病毒的囊膜蛋白。与VP88类似的是，VP19也存在于病毒囊膜组分中，且定位于病毒囊膜，证实VP19也是病毒的外囊膜蛋白。表达时序和药物抑制试验结果同时显示，VP19是SGIV的晚期转录本。在感染细胞中，VP19呈现与病毒加工厂共定位的特征。此外，VP19抗体对病毒入侵具有强烈的抑制作用，推测VP19可能在病毒入侵阶段发挥重要作用[14]。
2.2.3 免疫调节蛋白虹彩病毒和哺乳类大DNA病毒类似，也通过编码一些免疫调节蛋白类似物来调控病毒感染后的细胞命运。全基因组注释表明，SGIV VP136编码脂多糖诱导肿瘤坏死因子(LITAF)类似物；而VP50、VP51和VP96编码肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosis factor receptor, TNFR)类似物。研究发现SGIV LITAF作为早期基因，主要在细胞质内表达，并和线粒体相关。LITAF的表达能够明显地诱导细胞凋亡，同时伴随线粒体膜电势减低和Caspase-3的活性增强。此外，在SGIV LITAF过表达的细胞中，NF-κB和NFAT的活性也增强了[20]。有意思的是，SGIV LITAF与石斑鱼细胞来源LITAF存在共定位，推测两者可能通过互作调节细胞凋亡[21]。
对SGIV TNFR类似物的研究表明，尽管SGIV VP50、VP51和VP96均编码肿瘤坏死因子受体基因类似物，但含有的TNFR功能结构域–半胱氨酸富集结构域(Cysteine-rich domain, CRD)的数目存在明显差异，分别为4、3和2个，且三者在细胞中的亚细胞定位更是完全不一样，其中VP50在细胞质内呈弥散性均匀分布，第1个CRD对其细胞内定位和功能有影响。SGIV VP51也定位于细胞质中，CRD1、CRD2和跨膜结构域的缺失对VP51亚细胞定位有较大影响。在表达时序上，3个病毒基因也不尽相同。VP50和VP51为病毒的立即早期基因，VP96为病毒早期基因，揭示这3个病毒的TNFR类似物可能在病毒的感染过程中发挥不同的作用。过表达和缺失重组病毒的试验结果表明，体外过表达VP96能够促进细胞生长，并抑制病毒诱导的细胞凋亡，而过表达VP51促进细胞的生长和调节细胞周期，且过表达VP51显著抑制病毒诱导的细胞凋亡及Caspase-3活性，而促进病毒复制。相反地，缺失VP51 诱导细胞凋亡的能力增强，而病毒的毒力显著减弱，提示VP51是病毒感染复制的重要毒力因子。VP51缺失调节了病毒感染细胞或鱼体后宿主干扰素相关免疫因子或炎症因子的表达。推测VP51作为病毒重要毒力因子，可能通过调节宿主细胞凋亡和免疫炎症反应，从而影响病毒的感染与增殖[22-24]。对SGIV TNFR类似物的功能研究对于阐明SGIV感染过程中的免疫逃避机制具有重要意义。
2.2.4 病毒编码与细胞生长、信号转导相关基因的功能分析SGIV全基因组的生物信息学分析结果表明，病毒编码的一些基因可能参与调节细胞的生长和信号转导，如SGIV ORF049R编码1个尿密啶脱氧核糖核苷酸磷酸酶(dUTPase)，该基因为病毒的IE基因，分布在细胞核外的胞质区，且基因序列中的核输出信号对该基因的输出细胞核起决定性作用[25]。SGIV ORF062R含有1个保守的胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor, IGF)结构域，为IGF类似物。SGIV-IGF以点状定位于胞质中，过表达SGIV IGF可促进细胞生长和调节细胞周期从G1期向S期转换[26]。SGIV ORF155R编码信号素Semaphorin类似物，为病毒早期基因。SGIV semaphorin在病毒感染的细胞中主要定位于胞质及细胞膜上。过表达SGIV semaphorin对细胞生长没有影响，但可以通过改变细胞骨架结构促进SGIV复制[27]。
2.2.5 SGIV miRNA对病毒基因的调控在前期鉴定SGIV编码miRNA的基础上，进一步对部分病毒编码的miRNA靶标基因进行验证。病毒基因主要衣壳蛋白MCP的序列与SGIV miR-13互补，且miR-13可通过抑制SGIV MCP的表达，从而影响SGIV感染，证明SGIV MCP是miR-13的靶基因[28]。此外，生物信息学分析显示，SGIV miR-homoHSV的靶基因是SGIV LITAF。miR-homoHSV可以抑制SGIV诱导的细胞凋亡，且该作用可能通过抑制SGIV LITAF实现[29]。
3 SGIV感染致病的细胞基础 3.1 SGIV在石斑鱼宿主体内的感染分布对感染SGIV的石斑鱼进行传统的病理解剖观察发现，脾是SGIV感染最重要的靶器官。根据SGIV标志性蛋白—主要衣壳蛋白特异性基因序列，由地高辛标记的核酸分子探针对SGIV感染的石斑鱼组织器官进行原位杂交。结果发现，肾组织中的病毒信号最强，其次是脾、肝、肠道、胃和鳃等。SGIV主要感染这些器官组织的上皮和内皮细胞[30]。
3.2 SGIV感染宿主细胞的入侵方式、运动轨迹及侵染机制病毒吸附进入细胞是病毒感染的第一步。已有研究表明，虹彩病毒进入寄主细胞多依赖于网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞途径。运用单病毒粒子示踪技术结合分子生物学及免疫学技术，从时间、空间尺度多层次揭示SGIV的侵染机制。研究结果表明SGIV进入宿主细胞是通过网格蛋白和巨胞饮途径，而非小窝蛋白介导的胞吞途径。同时在活细胞水平实时监测到SGIV病毒沿着微管和微丝运动，经过早、晚期内吞体，最后到达溶酶体，且病毒的进入依赖于低pH。进一步研究证实SGIV编码的病毒蛋白VP69和VP101可能与内吞体Rab7发生相互作用[31-32](图2)。
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图 2 SGIV病毒进入介导的内吞方式[32] Fig. 2 The endocytosis mediated by SGIV entry a~c：SGIV病毒进入依赖于网格蛋白和巨胞饮，而不依赖于小窝蛋白，标尺为10 μm；d：SGIV进入细胞的模式图 a~c: SGIV enters grouper cells via the clathrin-mediated endocytic pathway and micropinocytosis, but not via caveola-dependent endocytosis, scale bars are 10 μm; d: Model entry route of SGIV into GS cells |
通过自主建立的基于原子力显微镜的微观生物力测量新方法—力示踪技术应用于研究SGIV侵染宿主细胞机制。病毒粒子进入细胞的位移峰值分别为180.2和81.0 nm，分别对应于病毒粒子连接在探针尖端或侧面时进入细胞的情况；2种情况下，病毒粒子进入细胞的时间分别为1.42和0.82 s。病毒粒子的最大瞬时速度约为200 nm/s。而应用恒定位置模式的力示踪技术能够测量单个SGIV病毒粒子进入宿主细胞的作用力，单个SGIV病毒粒子受到细胞的内吞作用力为60.8 pN[33]。相关研究结果极大地丰富了对虹彩病毒进入宿主细胞方式的认识，也拓展了单病毒粒子示踪技术在水生动物大分子DNA病毒研究中的应用。
3.3 SGIV感染诱导的细胞死亡机制细胞死亡是多细胞生物生命过程中重要的生理或病理现象。病毒在感染过程中，会引起细胞发生一系列形态变化，最终走向死亡，然而不同病毒诱发细胞死亡的方式和机制存在差别。我们利用自主建立的GS，比较SGIV感染引起宿主细胞GS和非宿主胖头鲤细胞(Fathead monnow cell line, FHM)死亡的异同，结果表明SGIV诱导细胞死亡具有细胞类型依赖性，即SGIV感染GS引起类凋亡，而感染FHM引起经典的凋亡[34]，且SGIV诱导的类凋亡依赖于病毒复制和新生蛋白合成，而SGIV诱导的细胞凋亡不需要病毒复制，表明病毒编码的蛋白能够诱导细胞凋亡。类凋亡是2000年Sperandio发现的一种新的细胞死亡类型，而SGIV引起的类凋亡是病毒感染诱导类凋亡的首次报道。
3.4 SGIV对宿主细胞信号通路的调节作用为更好地阐明SGIV感染致病的分子机制，利用转录组高通量测序分析SGIV感染石斑鱼前后脾组织中的基因表达情况，发现细胞内信号通路，如MAPK在SGIV感染后发生不同程度上调或下调，推测MAPK在病毒感染过程中可能发挥着关键的作用[35]。进一步研究表明，SGIV能显著激活ERK、p38MAPK和JNK分子的磷酸化，但激活形式有明显差别。对病毒SGIV感染复制而言，仅ERK和JNK信号是必需的，p38MAPK信号则参与SGIV诱导的细胞死亡[34, 36](图3)。为深入了解SGIV对MAPK信号的操控机制，克隆并鉴定了石斑鱼丝裂原活化蛋白激酶激酶7(MAPkinase kinase 7, MKK7)、p38MAPK、JNK1、JNK2、JNK3及c-Jun在SGIV感染过程中的功能，发现c-Jun在SGIV感染晚期转位到病毒装配区，推测c-Jun可能与病毒蛋白发生相互作用从而调控病毒复制[37-42]。
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图 3 SGIV能显著激活MAPK信号通路中关键的信号分子[34, 36] Fig. 3 SGIV infection significantly activates the key molecules in the MAPK signaling pathway a：SGIV能激活ERK的磷酸化；b：SGIV感染对MAPK信号通路的激活情况及MAPK信号通路在病毒感染过程中的作用模式图，SGIV：新加坡石斑鱼虹彩病毒，MAPK：丝裂原活化蛋白激酶，MEK：MAPK激酶，ERK：细胞外调节蛋白激酶，JNK：c-Jun氨基末端激酶，MAPKAPK：MAPK激活蛋白激酶 a: SGIV induces phosphorylation of ERK; b: Activation of MAPK signaling pathway induced by SGIV infection and the action of MAPK signaling pathway during virus infection, SGIV: Singapore grouper iridovirus, MAPK: mitogen-activated protein kinase, MEK: MAPK kinase, ERK: extracellular regulated protein kinases, JNK：c-Jun amino-terminal kinase, MAPKAPK: MAPK-activated protein kinase |
泛素–蛋白酶体系统是真核细胞内蛋白质降解的重要组成部分，在多种细胞进程中发挥着重要作用。此外，病毒侵染宿主细胞后，细胞的泛素系统与一些关键病毒蛋白发生复杂的相互作用，从而参与调节病毒的生活周期，包括病毒进入和运输以及病毒基因转录、蛋白合成、核酸复制、病毒出芽和释放等过程[43-44]。SGIV感染细胞的转录组学分析数据显示，泛素–蛋白酶体信号途径中65个基因受到不同程度的调控。抑制蛋白酶体的活性能够明显减少SGIV体外复制，抑制病毒装配区的形成，以及病毒基因转录和蛋白胞内的转运。而过表达石斑鱼泛素能部分回补蛋白酶体抑制剂对SGIV复制的抑制作用，表明蛋白酶体系统能够参与SGIV的复制。采用二维电泳和基质辅助吸附/电离时间–荧光质谱法，筛选SGIV感染过程中蛋白酶体系统调节的病毒或宿主蛋白，共鉴定出62种不同表达蛋白，包括15种病毒和47种宿主蛋白。宿主蛋白参与泛素介导的蛋白质降解、代谢、细胞骨架、大分子生物合成和信号转导[45]。三重基序蛋白(The tripartite motif-containing protein, TRIM)家族是一类结构保守、进化快速的E3泛素蛋白连接酶，参与生物诸多重要的生理生化过程。研究证明石斑鱼的多个TRIM蛋白参与调节免疫反应，从而影响病毒复制，TRIM25、TRIM8和TRIM32正调控干扰素反应或炎症因子，抑制病毒复制[46-48]，而TRIM62、TRIM82、TRIM35、TRIM16L和TRIM13负调控干扰素信号相关因子和促炎因子，促进SGIV的病毒复制[49-53]。
4 SGIV的分子检测技术迄今为止，尚无有效防治鱼类虹彩病毒病的方法。对病毒进行早期诊断和检测，是防控病毒病暴发和流行的重要措施。基于免疫学及分子生物学的原理，已研制开发出多种针对SGIV及病毒感染细胞的快速检测技术。
4.1 流式细胞技术基于免疫荧光抗体染色的流式细胞技术已经应用于人类医学病毒如爱滋病毒和登革热病毒的快速检测诊断。被病毒感染的细胞与耦联有荧光染料的特异性抗体结合后，可被流式细胞仪捕捉到并定量检出。利用自主制备的抗SGIV单克隆抗体，研制出一种新型的流式细胞检测技术，对感染鱼体和存在于海洋环境中的虹彩病毒进行大规模、快速和定量的检测[54]。流式细胞技术对于SGIV疫苗研制和抗病毒药物的快速和高通量筛选具有很高的研究和应用价值。
4.2 SGIV的微流控芯片检测技术平台系统近年发展的微流控或称芯片实验室技术平台(Lab-on-a-chip)可以实现在微升级的反应器内对病原微生物进行快速免疫学检测，极大降低检测样品和反应试剂的用量，缩短检测的时间。针对SGIV，利用硅和有机高分子材料研究开发出一系列大小只有2 cm×2 cm的芯片实验室系统。基于抗体作探针的Lab-on-a-chip系统只需3~5 min即可检测出感染SGIV的单个细胞。此外，利用量子点(Quantum dot, QD)荧光标记结合抗体包被微珠技术直接检测到SGIV病毒粒子，检测信号灵敏、稳定[55]。该系统在海洋微生物功能基因组学，以及新药筛选、病原检测、环境保护、食品安全和外来生物入侵等方面具有重要的研究和应用价值。
4.3 SGIV的LAMP检测方法针对SGIV特异基因(ORF-014L)的核酸序列，建立了一种简单、快速、敏感而且特异性高的检测方法LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)。该方法的检测灵敏度为0.02 fg质粒DNA(相当于6.3拷贝病毒基因组DNA)。应用该方法成功检测感染细胞以及鱼组织中的SGIV，并有潜力应用于野外检测[56]。
4.4 SGIV核酸适配体的筛选及检测方法指数富集的配基系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)是一种生物文库筛选技术，由于核酸适配体具有筛选靶物质广泛、特异性强、亲和力高等诸多优点，目前已发展成为一种备受关注的新型检测和治疗工具。以SGIV病毒或病毒感染细胞为筛选靶标，综合运用SELEX、磁性分离、流式细胞分析、凝胶阻滞和荧光显微观察等技术筛选获得高特异性的核酸适配体。筛选得到的核酸适配体无任何毒副作用；部分适配体可以抑制病毒的感染[57-58]。基于病毒感染细胞筛选得到的核酸适配体，研发出新型的酶联免疫检测技术(Aptamer-based enzyme-linked apta-sorbent assay, Apt-ELASA)。Apt-ELASA可以在石斑鱼养殖过程中快速检测虹彩病毒的感染，具有操作简便快捷、稳定性强、灵敏度高等优点[59]。
5 石斑鱼抗病毒免疫相关基因的鉴定和功能研究 5.1 一种新型抗SGIV蛋白的分离和鉴定为从海洋生物中获得能与病毒结合的抗病毒蛋白，用纯化的石斑鱼虹彩病毒作配体，采用亲和层析技术从斑节对虾血淋巴中分离出一种能与SGIV结合的蛋白，经蛋白质组学技术鉴定为血蓝蛋白。鱼类病毒感染抑制试验结果表明，该血蓝蛋白具有非特异性广谱抗病毒活性，能抑制SGIV和神经坏死症病毒等多种鱼类病毒[60]。这为鱼类抗病毒研究提供了一种新的思路。
5.2 石斑鱼免疫相关基因的筛选和功能分析利用抑制性消减杂交(Suppression subtractive hybridization，SSH)结合基因芯片技术，成功构建了石斑鱼感染SGIV的SSH文库，获得413个差异表达基因，其中有13个免疫相关基因[61]。利用454高通量测序技术，完成了SGIV感染前后石斑鱼的转录组分析，揭示多个基因与免疫和抗病毒相关[35]。在石斑鱼模式识别受体及信号通路中关键分子研究方面，已克隆并鉴定一系列RLR或cGAS/STING信号通路中接头分子及干扰素刺激基因，包括黑色素瘤分化相关基因5(Melanoma differentiation associated gene 5, MDA5)、LGP2(Laboratory of genetics and physiology 2)、线粒体抗病毒信号蛋白(Mitochondrial antiviral signaling protein, MAVS)、肿瘤坏死因子受体相关因子(TNF receptor associated factor, TRAF)、干扰素基因刺激剂(Stimulator of interferon genes, STING)和TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1, TBK1)，干扰素调节因子3(Interferon regulator factor, IRF)、IRF7和核因子κB激酶抑制剂(Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase, IKKa)，并完成了部分基因的抗体制备和抗病毒功能活性的验证[62-70]，证明在石斑鱼的GS细胞中存在完整的RLR或cGAS/STING的信号通路。前期的研究结果推测SGIV能够调节Janus激酶/信号转导与转录激活子(JAK-STAT)信号通路，为探讨该信号通路是否参与病毒复制，克隆和证明了JAK-STAT信号通路及下游关键分子在SGIV感染过程中的作用，包括STAT1、STAT3和干扰素刺激基因15(Interferon stimulated gene 15, ISG15)[71-72]。此外，还克隆表达了多个石斑鱼凝集素基因，包括C型凝集素(C-type lectin, CTL)，C型凝集素样(C-type lectin-like)和半乳糖凝集素基因，过表达石斑鱼的半乳糖凝集素基因能抑制SGIV病毒的复制[73-75]。
在石斑鱼抗病功能蛋白研究方面，克隆鉴定了石斑鱼抗菌肽、溶菌酶和防御素等重要的抗病基因。如石斑鱼抗菌肽Hepcidin l和Hepcidin 2不仅具有明显的抗菌活性，也能明显地抑制SGIV复制[76]。防御素是一类在宿主先天性免疫中具有重要作用的内源性抗菌肽。石斑鱼的防御素能够诱导I型干扰素相关的免疫反应，对病毒SGIV和VNNV表现出双重抗病毒活性[77]。在石斑鱼中克隆到C型和G型2类溶菌酶，其中C型溶菌酶的重组蛋白对溶壁微球菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌和海豚链球菌都有一定的抑制作用，且过表达该基因能抑制SGIV复制，而G型溶菌酶仅显示出较强的溶菌活性，对病毒复制没有明显影响[78-79]，推测石斑鱼G型溶菌酶可能主要参与石斑鱼抗菌天然免疫反应。石斑鱼抗病功能蛋白的筛选和鉴定可为石斑鱼抗病毒药品的研制提供重要的理论信息。
6 SGIV免疫防控的研究化学药物的滥用容易造成环境污染和药物残留，也使得病原对抗生素的耐药性日益增强，因此开发低成本、高效疫苗以及具有抗菌、抗病毒功能的产品，对重大流行性疾病进行免疫防治，已成为国际主流的研发方向。使用甲醛和β−丙内酯对SGIV进行灭活，制备病毒感染细胞的灭活疫苗，所制得的SGIV灭活疫苗具有高度安全性，对病原的相对免疫保护率为92.3%。说明SGIV灭活疫苗具有较好的免疫保护效力，对防治SGIV病毒病有很高的应用价值[80]。免疫学分析结果表明，SGIV灭活疫苗可能通过激活I型干扰素信号通路或鱼类体液和细胞免疫反应从而达到抵抗病原感染的目的。此外，根据SGIV全基因组序列信息，运用反向疫苗学分析方法，从大量的病毒编码基因中鉴定到了3个能产生明显保护作用的基因：SGIV VP36、SGIV VP39和SGIV VP72，其相对保护率分别是50.00%、66.67%和66.67%[81]，其中，将SGIV VP72表达的蛋白与氢氧化铝佐剂配伍后制备成亚单位疫苗，免疫鱼体后疫苗相对保护率约达到68%。鉴于DNA疫苗和亚单位疫苗免疫效果欠佳，需要配伍合适的佐剂才能有效提高疫苗的免疫保护效果。
7 展望对SGIV的研究从病毒分离、纯化、理化性质、感染致病分子机制及免疫防控等多方面已取得了重要进展。未来还需要从以下方面开展研究工作：1)深入研究病毒基因的功能，由于SGIV是蛙病毒属的新种，存在大量未知的功能基因，针对这些未知功能的基因开展研究不仅能够帮助我们了解病毒更深层次的致病机制，而且可以为弱毒疫苗研发提供参考；2)继续开展病毒与宿主互作机制的研究，对SGIV进入宿主细胞的受体开展研究，将帮助我们理解病毒进入宿主细胞的精细机制，同时可为有效抗病毒药物的开发提供有效靶标；3)开展病毒感染的代谢免疫组学研究，结合多组学、病理学、生物化学和细胞分子生物学等技术手段，从病毒感染引起宿主体内外的代谢物–基因–蛋白及病理变化等多层次整合分析病毒感染导致细胞代谢变化与病理变化的关联性，阐明病毒调节和利用宿主代谢、以及宿主应对病毒侵染的代谢免疫调控作用机制，深入揭示SGIV病毒与宿主细胞相互作用的分子机制。
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