抗生素耐药问题已经成为全球威胁人类和动物健康的重大问题之一，人医和兽医临床对抗菌药的长期过多使用或不合理使用加速了细菌耐药性的出现和传播。大肠埃希菌Escherichia coli是革兰阴性兼性厌氧菌，是人和动物肠道内的共生菌，同时也是最常见的环境机会致病菌之一^[1]。大肠埃希菌对抗生素压力较敏感，易产生耐药性，同时还可通过细菌之间的菌毛接触使耐药基因在菌株菌种间传播。由于抗菌药长期的不合理使用，我国大肠埃希菌的耐药问题十分严峻。据2017 年 CHINET中国细菌耐药性监测调查结果显示，国内主要地区临床分离大肠埃希菌对头孢噻肟、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、哌拉西林和磺胺甲噁唑−甲氧苄啶的耐药率接近或高于50%^[2]。国内食品动物源分离的大肠埃希菌对氨苄西林、四环素类和磺胺类等抗菌药耐药率高于75%，对氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗菌药耐药率高于50%^[3]，但对头孢菌素耐药率较低，低于35%^{[1, 3]}。大肠埃希菌对头孢菌素、氟喹诺酮类等重要药物的耐药基因常位于质粒上，易于传播扩散，促进了大肠埃希菌耐药性的发展，引起了全球关注。

宠物作为人类的伴侣动物，共同的生存环境和长期的直接接触使宠物源细菌成为耐药基因在人类和环境间传播的重要媒介。已有研究证明，宠物和人类之间的频繁或亲密接触会增加耐药细菌向人类传播的可能性^[4]，携带耐药基因的大肠埃希菌能在宠物体内定植，并且在宠物与人之间传播^[5]。目前，国内外对畜牧养殖及动物源性食品、人医临床和环境中大肠埃希菌耐药性以及耐药基因的研究较多，而关于宠物源大肠埃希菌耐药性的研究较少^[6]。因此，本研究旨在调查健康和患病宠物分离的大肠埃希菌耐药状况和重要耐药基因的流行情况，为伴侣动物临床用药和公共卫生安全发展提供参考。

2016年7月至2017年7月从广州市4家宠物医院采集健康动物和患病动物样品共319份，包括粪便251份、鼻液25份、尿液23份、皮肤6份、耳分泌物6份、唾液4份、眼分泌物2份、血液1份和脓肿渗出物1份。其中健康动物127份，患病动物192份。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922由华南农业大学广东省兽药研制与安全评价重点实验室保存。

氨苄西林(Ampicillin，AMP)、头孢噻肟(Cefotaxime，CTX)、头孢他啶(Ceftazidime，CAZ)、庆大霉素(Gentamicins，GEN)、阿米卡星(Amikacin，AMI)、盐酸四环素(Tetracycline，TET)、多西环素(Doxycycline，DOX)、氟苯尼考(Florfenicol，FFC)、环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、磷霉素(Fosfomycin，FOS)和磺胺甲噁唑−甲氧苄啶(Sulfadimidine-Trimethoprim,SMZ-TMP)均购自大连美仑生物技术有限公司。

麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、LB肉汤、LB琼脂购自青岛海博生物技术试剂有限公司；水解酪蛋白琼脂、水解酪蛋白肉汤购自广州环凯微生物有限公司；rTaq DNA聚合酶、dNTP Mixture、DL2000 DNA Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司。

将样品接种于LB肉汤，37 ℃震荡培养过夜；蘸取菌液划线接种于麦康凯琼脂板上，37 ℃静置培养16~18 h；挑取麦康凯板上红色、不透明、中等大小的可疑单菌落划线接种于伊红美蓝琼脂板上，37 ℃静置培养16~18 h；挑取黑绿色带有金属光泽、中等大小的可疑单菌落均匀涂布于LB琼脂板上，进行培养和鉴定。

利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)进行菌种鉴定。用接种环在LB琼脂板上取适量菌苔加入300 μL去离子水中，混匀后加入900 μL无水乙醇，混匀后10 000 r/min离心2 min,倒去上清液，晾干后加50 μL 体积分数为70%的甲酸溶液混匀，加入50 μL乙腈，混匀后10 000 r/min离心2 min，取1 μL上清液均匀点样到靶板上，室温干燥后将1 μL基质液涂敷于点上，室温干燥。最后，取 1 μL标准品滴加到 MALDI靶板，室温晾干后将1 μL基质涂敷于样品点上，室温干燥，将金属靶板上机检测。

参照美国临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推荐的操作方法，用琼脂稀释法测定大肠埃希菌对β−内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类、磷霉素类、磺胺类和喹诺酮类等7类 共11种抗菌药物的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)，以大肠埃希菌ATCC 25922为质控菌株，依据CLSI的标准^[1]判断大肠埃希菌对11种抗生素的耐药性，分为耐药、中介和敏感。利用Excel整理数据，运用卡方检验进行耐药率差异显著性比较分析。

将−80 ℃保存的大肠埃希菌划线于麦康凯琼脂板上，37 ℃培养16~18 h，挑取单菌落均匀涂布于LB琼脂板上，37 ℃培养16~18 h，取适量菌苔重新悬浮于500 μL 1×TE中，100 ℃加热15 min，冰浴10 min，12 000 r/min离心5 min，上清液为制备好的DNA模板，将其放于4 ℃保存备用。

利用PCR和测序技术对大肠埃希菌进行耐药基因的检测，包括bla_CTX-M-1G、bla_CTX-M-2G、bla_CTX-M-9G、bla_CTX-M-25G、bla_CMY-2、rmtB、fosA3和floR，引物序列和扩增片段长度见表1，引物由华大基因有限公司合成。设置25 μL的反应体系，包括模板DNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、10×rTaq Buffer 2.5 μL、dNTP Mixture 2 μL、rTaq 0.125 μL、灭菌双蒸水18.375 μL，对目的基因进行扩增，同时设置阳性和阴性对照。PCR产物由上海生工生物工程有限公司进行测序分析。

表 1 Table 1

表 1 检测耐药基因的引物序列 Table 1 Sequences of primers used to screen resistance genes 　　基因 　　Gene 引物序列(5′→3′) Primer sequence 片段大小/bp Segment size 参考文献 Reference blaCTX-M-1G F:CTTCCAGAATAAGGAATCCC 949 [7] R:CGTCTAAGGCGATAAACAAA blaCTX-M-2G F:ATGATGACTCAGAGCATTCG 857 [8] R:TCAGAAACCGTGGGTTACGA blaCTX-M-9G F:TGACCGTATTGGGAGTTTG 902 [7] R:ATGATGACTCAGAGCATTCG blaCTX-M-25G F:AATGTTCAGGGGATTAGGA 876 [7] R:ATCACTCCACATGGTGAGTA blaCMY-2 F:TGGCCGTTGCCGTTATCTAC 870 [9] R:CCCGTTTTATGCACCCATGA fosA3 F:GCGTCAAGCCTGGCATTT 282 [10] R:GCCGTCAGGGTCGAGAAA floR F:CTGAGGGTGTCGTCATCTAC 673 [9] R:GTCCCGACAATGCTGACTAT rmtB F:ATATCAACGATGCCCTCAC 725 [11] R:AAGTTCTGTTCCGATGGTC

表 1 检测耐药基因的引物序列 Table 1 Sequences of primers used to screen resistance genes

根据MALDI-TOF MS的检测结果确定从广州市宠物医院319份样品中分离到大肠埃希菌203株，分离率为63.64%，从粪便、鼻液、尿液、耳分泌物和皮肤中分别分离出178株(分离率为70.91%)、12株(分离率为48.00%)、8株(分离率为34.78%)、3株(分离率50.00%)和2株(分离率33.33%)。其中健康动物样品中分离出94株，分离率为74.02%；患病动物109株，分离率为56.77%。

大肠埃希菌对各种抗菌药的耐药率如表2所示，其中对氨苄西林的耐药率最高，达到76.85%；其次是头孢噻肟、四环素、多西环素和磺胺甲噁唑−甲氧苄啶，耐药率均高于50%；耐药率最低的为阿米卡星，仅为10.84%。患病动物源大肠埃希菌对全部受测药物的耐药率均高于健康动物，除阿米卡星、氟苯尼考和磷霉素外，其他药物均差异极显著(P < 0.01)。

表 2 Table 2

表 2 203株大肠埃希菌耐药率 Table 2 Antimicrobial resistance rates of 203 Escherichia coli isolates 药物 Drug 健康动物源(n=94) Strains from healthy animals 患病动物源1)(n=109) Strains from sick animals 全部菌株(n=203) Total strains 氨苄西林 AMP 65.96 86.24** 76.85 头孢噻肟 CTX 42.55 67.89** 56.16 头孢他啶 CAZ 12.77 31.19** 22.66 庆大霉素 GEN 28.72 46.79** 38.42 阿米卡星 AMI 7.45 13.76 10.84 四环素 TET 48.94 82.57** 67.00 多西环素 DOX 36.17 66.06** 52.22 氟苯尼考 FFC 35.11 44.95 40.39 环丙沙星 CIP 29.79 59.63** 45.81 磷霉素 FOS 32.98 34.86 33.99 磺胺甲噁唑−甲氧苄啶 SMZ-TMP 38.30 74.31** 57.64 　1) “**”表示与健康动物源大肠埃希菌的耐药性差异极显著(P<0.01，卡方检验) 　1) “**” indicates significant difference from drug resistance rate of Escherichia coli of healthy animals (P < 0.01, chi-square test)

表 2 203株大肠埃希菌耐药率 Table 2 Antimicrobial resistance rates of 203 Escherichia coli isolates

203株大肠埃希菌中有179株菌(88.18%)至少对1种抗生素耐药，1~2耐为29株(14.29%)，3~5耐为52株(25.62%)，6~8耐为64株(31.53%)，9~10耐为29株(14.29%)，有5株(2.46%)菌对11种药物均耐药。所有耐药菌中，耐3种和6种药物的菌株最多，均有25株(12.32%)，其次是耐8种药的菌株，共有23株(11.33%)。24株大肠埃希菌对11种药物均敏感，其中健康动物源19株，患病动物源5株。健康动物源大肠埃希菌中耐药菌株占79.79%，耐1种药物的菌株最多，占12.77%，耐9种及以上药物的菌株占13.82%；患病动物源大肠埃希菌中耐药菌株占95.41%，耐6种药物的菌株最多，占18.35%，耐9种及以上药物的菌株占19.27%(表3)，表明患病动物源大肠埃希菌多药耐药情况较健康动物源菌更为严重。

表 3 Table 3

表 3 大肠埃希菌多重耐药情况 Table 3 Multi-drug resistance of Escherichia coli 耐药数 Number of drug resistance 健康动物源(n=94) Strains from healthy animals 患病动物源(n=109) Strains from sick animals 所有菌株(n=203) Total strains 菌株数 Number of strains 耐药率/% Drug resisitance rate 菌株数 Number of strains 耐药率/% Drug resisitance rate 菌株数 Number of strains 耐药率/% Drug resisitance rate 0 19 20.21 5 4.59 24 11.82 1 12 12.77 1 0.92 13 6.40 2 11 11.70 5 4.59 16 7.88 3 8 8.51 17 15.60 25 12.32 4 10 10.64 5 4.59 15 7.39 5 5 5.32 7 6.42 12 5.91 6 5 5.32 20 18.35 25 12.32 7 7 7.45 9 8.26 16 7.88 8 4 4.26 19 17.43 23 11.33 9 9 9.57 10 9.17 19 9.36 10 3 3.19 7 6.42 10 4.93 11 1 1.06 4 3.67 5 2.46

表 3 大肠埃希菌多重耐药情况 Table 3 Multi-drug resistance of Escherichia coli

耐药基因的检测结果如表4所示，其中bla_CTX-M检出率最高，共有78株菌携带bla_CTX-M，主要为bla_CTX-M-1G群和bla_CTX-M-9G群，分别检出41株和46株，bla_CTX-M-1G包括bla_CTX-M-55(n=23)、bla_CTX-M-15(n=10)、bla_CTX-M-64(n=7)和bla_CTX-M-123(n=1)，bla_CTX-M-9G包括bla_CTX-M-14(n=19)、bla_CTX-M-27(n=19)和bla_CTX-M-65(n=8)；健康动物源大肠埃希菌中bla_CTX-M-55最为流行，检出率为9.57%，患病动物源菌中bla_CTX-M-55和bla_CTX-M-27最为流行，检出率均为12.84%；未检测到bla_CTX-M-2G和bla_CTX-M-25G。floR、fosA3、rmtB、和bla_CMY-2分别检出71株、36株、21株和3株。78株携带bla_CTX-M菌株中，有55株(70.51%)同时携带floR、fosA3、rmtB或bla_CMY-2等其他耐药基因。

表 4 Table 4

表 4 203株大肠埃希菌耐药基因检出率 Table 4 Detection rates of resistance genes from 203 Escherichia coli isolates 耐药基因 Resistance gene 健康动物源(n=94) Strains from healthy animals 患病动物源(n=109) Strains from sick animals 所有菌株(n=203) Total strains 菌株数 Number of strains 检出率/% Detection rate 菌株数 Number of strains 检出率/% Detection rate 菌株数 Number of strains 检出率/% Detection rate blaCTX-M-1G 11 11.70 30 27.52 41 20.19 blaCTX-M-9G 14 14.89 32 29.36 46 22.66 blaCTX-M-2G 0 0 0 0 0 0 blaCTX-M-25G 0 0 0 0 0 0 floR 26 27.66 45 41.28 71 34.97 fosA3 14 14.89 22 20.28 36 17.73 rmtB 6 6.38 15 13.76 21 10.34 blaCMY-2 2 2.13 1 0.92 3 1.48

表 4 203株大肠埃希菌耐药基因检出率 Table 4 Detection rates of resistance genes from 203 Escherichia coli isolates

大肠埃希菌是人类和动物最常见的病原体之一，极易产生耐药性，并且能将耐药基因在不同菌种间扩散，宠物作为耐药基因的“储存库”，可将耐药基因传播至人，给人类的健康带来潜在的威胁^[12]。本研究在2016年7月至2017年7月间从广州市4家宠物医院的宠物源样品中分离得到203株大肠埃希菌。从药物敏感性试验结果来看，203株菌中有179株(88.18%)对11种抗生素有不同程度的耐药性，对头孢噻肟、四环素、多西环素和环丙沙星的耐药率在45%~67%之间，结果与何柳等^[13]2007—2008年从广州市健康或患病犬猫分离的宠物源大肠埃希菌耐药率相似；对氨苄西林、磺胺甲噁唑−甲氧苄啶、庆大霉素和阿米卡星的耐药率分别为76.85%、57.64%、38.42%和10.84%，明显低于何柳等^[13]前期报道的结果，氟苯尼考耐药率为40.39%，明显高于何柳等^[13]报道的对宠物源大肠埃希菌的耐药率(18.80%)^[13]。与国内其他地区相比，氨苄西林、头孢噻肟、四环素和磺胺甲噁唑−甲氧苄啶的耐药率与河南地区、青海地区和吉林地区所报道的宠物源大肠埃希菌耐药率相似，耐药率均高于50%^[14-17]；庆大霉素和阿米卡星的耐药率与江苏省扬州地区宠物源大肠埃希菌相似^[18]；氟苯尼考耐药率低于其他地区^[14-18]。目前国外已有不少关于宠物源大肠埃希菌耐药性的研究，澳大利亚2017年报道的犬源大肠埃希菌对氨苄西林的耐药率不足30%，对头孢噻肟和四环素的耐药率不足15%，对环丙沙星的耐药率低于10%^[6]；美国报道的健康伴侣动物大肠埃希菌对氨苄西林、头孢喹肟和四环素的耐药率在6%左右，对氟喹诺酮类的耐药率低于0.5%^[19]，远低于国内宠物源大肠埃希菌耐药率。本研究分离的203株宠物源大肠埃希菌有150株菌(73.89%)存在多重耐药现象，健康动物源菌和患病动物源菌多重耐药率分别为55.31%和89.91%，与国内其他报道相似，但比国外宠物源大肠埃希菌多重耐药情况严重，健康动物源菌耐药在20%以下^{[5, 19-21]}，新加坡报道的患病动物多重耐药率为67%^[22]，远低于本研究。此外，11种抗菌药的药物敏感试验结果显示患病动物源大肠埃希菌的耐药率均高于健康动物源，除阿米卡星、氟苯尼考和磷霉素外，其他药物均差异极显著( P < 0. 01)，提示动物患病后抗菌药物的使用显著增加了细菌对抗生素的耐药性。

自1998年西班牙首次在宠物源中发现产超广谱β−内酰胺水解酶(Extended spectrum beta-lactamases,ESBLs)大肠埃希菌以来，关于宠物源产ESBLs大肠埃希菌的报道越来越多，目前宠物已被公认为全球ESBL的重要来源之一，而且可能也是人类获得ESBL的来源^[23]。ESBLs耐药基因包括bla_CTX-M、bla_OXA、bla_TEM和bla_SHV等，介导对头孢菌素耐药，其中bla_CTX-M流行最为广泛，在中国，最广泛的为bla_CTX-M-1群和bla_CTX-M-9群基因^[24]；质粒介导的AmpC β−内酰胺酶(pAmpC)，也能介导对β−内酰胺类药物耐药，最流行的耐药基因为bla_CMY-2^[25]，本研究对分离到的所有菌株进行bla_CTX-M-1G、bla_CTX-M-9G和bla_CMY-2的PCR检测，结果表明，bla_CMY-2的检出率较低，介导头孢菌素类药物耐药的耐药基因主要为bla_CTX-M-1G和bla_CTX-M-9G，其中bla_CTX-M-55和bla_CTX-M-14是主要的基因型，与bla_CTX-M在国内动物源中的流行情况相符^[26]。氟苯尼考是一种广谱的动物专用的氯霉素类抗生素，质粒编码的耐药基因floR是介导氟苯尼考耐药的主要因素之一，本研究中floR检出率为34.97%，低于贺志沛等^[14]报道的河南地区floR检出率(45.00%)。磷霉素是一种传统的广谱抗菌药，用于治疗产ESBL肠杆菌和氟喹诺酮类耐药肠杆菌，fosA3是流行最广泛的质粒介导的磷霉素耐药基因之一，Hou等^[11]前期发现广东省2006—2010年分离的宠物源大肠埃希菌中fosA3检出率为9.00%，低于本研究中的17.73%。rmtB编码16S甲基化酶，介导对阿米卡星等氨基糖苷类药物耐药，本研究中共有21株菌株携带rmtB。值得注意的是，有70.51%携带bla_CTX-M基因的菌株还同时携带有floR、fosA3 和rmtB等其他耐药基因，由于多种耐药基因共同存在同一菌株中，使得一种药物的使用可以筛选出多个耐药基因。磷霉素未被批准用于宠物临床，fosA3的流行可能是头孢菌素、氨基糖苷类、氟喹诺酮类药物等其他药物在宠物临床的使用中共同筛选的结果。

从本研究可以看出，广州地区宠物源大肠埃希菌的耐药情况与国内不同地区报道的宠物源大肠埃希菌耐药率相似，但比国外宠物源大肠埃希菌耐药情况严重许多，并且患病动物耐药情况明显比健康动物严重。宠物因其与人类直接接触的时间较长，可以作为耐药基因的“宿主”将其传给人类，同时也能接受来自人类的耐药基因；宠物源细菌是耐药性传播的重要环节之一，然而国内对宠物源细菌耐药性的研究却远远少于食品动物源，所以应当加强对宠物源菌的耐药性监测，合理选择抗菌药物治疗细菌感染，减缓细菌耐药性的发展。