α−酮戊二酸是三羧酸循环中的中心物质，是机体内重要的代谢中间产物，在机体的免疫调节^[1]、肠道健康^[2]、蛋白质合成^[3]、骨骼发育^[4]、延缓衰老^[5]和抗癌^[6]等方面发挥着重要作用。目前α−酮戊二酸主要通过化学合成法生产^[7]，但过程复杂和有毒化学试剂的污染等问题严重制约了化学合成方法大规模生产α−酮戊二酸。微生物发酵法生产α−酮戊二酸作为代替化学合成的方法已经相对比较成熟。但目前微生物发酵法生产α−酮戊二酸全部是采用液体发酵^[8]，而采用固态发酵模式生产α−酮戊二酸的相关研究鲜见报道。

固态发酵饲料是近年来生物饲料产业新兴领域之一^[9]。与普通饲料相比，发酵饲料不仅能消除抗营养因子，发挥预消化功能，而且在发酵过程中能产生大量的酶、有机酸以及各种代谢中间产物。但目前关于发酵饲料代谢产物种类和功能的研究报道较少，也鲜有针对特定代谢中间产物的靶向发酵菌种和工艺探索。因此，本文将α−酮戊二酸的生物发酵和发酵饲料有机结合，重点对常规固态发酵菌株(包括乳酸菌、酵母菌和曲霉菌Aspergillus等)进行了筛选，并采用代谢物调控的方法对固态发酵过程中α−酮戊二酸的累积量进行研究。最后，通过日粮中添加发酵物，验证其对动物生长、免疫功能和肠道健康的调控作用。本文是对固态发酵法生产α−酮戊二酸的积极探索，同时也为靶向代谢中间产物发酵饲料的生产应用提供一定参考价值。

1 材料与方法 1.1 材料

菌株由广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所提供。豆粕、麸皮和玉米粉购自广东华红饲料科技有限公司。4周龄C57/BL小鼠购于广东省医学实验中心。试验仪器有霉菌培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，MJ-250-II型)；液相色谱仪(美国安捷伦科技公司，1290型)；清醒小动物体成分分析仪(上海纽迈科技有限公司，MesoQMR23-060H型)；高压蒸汽灭菌锅(日本HIRAYAMA公司，HVE-50型)；超净工作台(中国苏州净化集团安泰公司，SW-CJ-1F型)。

1.2 发酵菌液的制备

将保藏的菌种嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus MIA、嗜酸乳杆菌 HSY、粪肠球菌Enterococcus faecalis、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、乳酸菌接种到装有50 mL MRS肉汤培养基的250 mL三角瓶中，置于37 ℃条件下培养3 d。将保藏的菌种酵母菌、黑曲霉Aspergillus niger、木霉菌Trichoderma spp.接种到装有50 mL麦芽汁培养基的250 mL三角瓶中，将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的菌种接种到装有50 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，置于全温振荡器(30 ℃、170 r/min)中培养24 h，使得菌数为20×10⁸ /mL。

1.3 发酵方法

将灭菌后的豆粕、玉米粉、麸皮按3∶6∶1的质量比准确称取30 g于烧杯中，加入30 mL灭菌水(含体积分数为5%的发酵菌液)并搅拌均匀，然后铺入平皿中，其中嗜酸乳杆菌MIA、嗜酸乳杆菌HSY、粪肠球菌、植物乳杆菌、乳酸菌发酵的平皿用封口膜封闭，进行厌氧发酵。酵母菌、黑曲霉、木霉菌、枯草芽孢杆菌发酵的平皿不封闭，进行有氧发酵。将所有平皿置于霉菌培养箱中，于37 ℃条件下发酵72 h，每组3个重复。在添加琥珀酸时，将其加入到灭菌水中，pH调至7。发酵结束后，取发酵料10 g用于检测pH和代谢物的含量。

1.4 代谢产物的测定

代谢产物的提取：称取0.2 g未烘干发酵物料置于离心管中，进行超声破除，然后使用滤纸过滤，将滤液用乙醇沉淀蛋白后，取上清液12 000 r/min离心10 min，上清液用ValueLab针式过滤器过滤后进行分析；流动相的配制：准确称取5 g 磷酸氢二铵，用蒸馏水溶解并定容至1 000 mL，用磷酸调节pH至2.5。用0.22 µm微孔过滤膜进行真空超滤，然后用超声波脱气；标准溶液的配制：精确称取一定量的苹果酸、α−酮戊二酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸的标准品用超纯水配制成终质量浓度分别为1.2 mg/mL、240 µg/mL、10 mg/mL、1.5 mg/mL和5 µg/mL的有机酸标准混合液，然后用ValueLab针式过滤器过滤；上机检测：使用安捷伦色谱柱SB-Aq C₁₈(4.6 mm×250 mm, 5 µm)，以5 g/L (NH₄)₂HPO₄-H₃PO₄ (pH2.5)缓冲液作为流动相，流动相流速为0.8 mL/min，柱温30 ℃，紫外检测波长为214 nm。

1.5 动物试验设计

饲养试验选用4周龄雄性小鼠16只，按体质量(18 g左右)相近原则随机分为2组：对照组添加质量分数为5%的普通发酵物(枯草芽孢杆菌正常发酵，不做任何处理)，试验组添加质量分数为5%的富含α−酮戊二酸发酵物(枯草芽孢杆菌发酵过程中添加质量分数为1% 的琥珀酸)，试验过程中，小鼠自由采食。

1.6 小鼠吞噬细胞吞噬能力的测定

用水将印度墨汁稀释4倍，然后按小鼠体质量，每10 g体质量尾静脉注射0.1 mL稀释后的印度墨汁，随后分别于 2 min(t₁)和 10 min(t₂)进行上颚静脉采血 20 μL，加入到 2 mL 1 g/L的Na₂CO₃溶液中，振荡混匀，在680 nm测量光密度，t₁和t₂血液样品的光密度分别用 D_{680 nm}和 D′_{680 nm}表示。随后处死小鼠，称取肝脏和脾脏质量，计算各组小鼠碳廓清指数(K)和吞噬指数(α)。

$ \begin{align} &K=\dfrac{\lg D_{680 \;{\rm{nm}}}-\lg D'_{680 \;{\rm{nm}}}}{{t}_2-{t}_1}{\text{，}}\\ &\alpha = \dfrac{{{\sqrt[3]{K}}\times {\text{体质量}}}}{{{\text{肝脏质量}} + {\text{脾脏质量}}}}{\text{。}} \end{align} $

1.7 HE染色

剪取2~3 cm肠道组织放入体积分数为4%的多聚甲醛溶液中固定，固定24~36 h，脱水后进行石蜡包埋。用平推切片机切成 5 μm切片，贴片于载玻片上，置于烘片机上烘干。配置HE染色所需试剂于染缸中。HE染色步骤：切片放入二甲苯溶液中脱蜡2次，每次15 min；随后放入无水乙醇浸泡2次，每次15 min，然后依次放入体积比为95%、85%、75%的乙醇溶液中各浸泡5 min；流水冲洗10 min，苏木精染色2 min，迅速流水冲洗10 min，盐酸反蓝数秒后流水冲洗10 min；伊红(用体积比为70%的乙醇溶液将伊红溶解)染色3 min，无水乙醇浸泡2次，每次5 min，二甲苯溶液浸泡透片2次，每次5 min，中性树脂胶加盖玻片封片晾干。

1.8 小鼠血象的测定

对小鼠禁食禁水12 h，次日上午从每个处理组随机取6只小鼠，眼眶采血，保存于EDTA抗凝管中，暂时存放于4 ℃冰箱中，当日送广东省医学实验动物中心检测血象。

2 结果与分析 2.1 固态发酵生产α−酮戊二酸的菌株筛选

采用液相色谱对α−酮戊二酸进行定量检测(图1A)，α−酮戊二酸质量浓度与峰面积的线性回归方程相关系数为0.999 8，说明α−酮戊二酸的浓度与峰面积呈良好的线性关系(图1B)。对9种菌株发酵物检测发现，在固态发酵模式下，酵母菌可以产生微量约13 μg/g的α−酮戊二酸，枯草芽孢杆菌可以产生约60 μg/g的α−酮戊二酸，其余菌株未检测到α−酮戊二酸。故后续选择枯草芽孢杆菌作为发酵菌株(图2)。

2.2 琥珀酸对枯草芽孢杆菌固态发酵产生α−酮戊二酸的影响

筛选出枯草芽孢杆菌后，进一步通过代谢物(琥珀酸)调控其发酵过程，使枯草芽孢杆菌在固态发酵模式中过量积累α−酮戊二酸。结果发现，随着琥珀酸添加量的增高，枯草芽孢杆菌发酵累积的α−酮戊二酸含量逐渐上升，但当添加琥珀酸的质量分数达到0.8%以上，α−酮戊二酸含量达到平稳。添加质量分数为1.0%的琥珀酸时，α−酮戊二酸的产出率可以达到0.3%(w)(图3、图4)。

2.3 日粮添加富含α−酮戊二酸发酵物对小鼠生长的影响

与对照组相比，日粮添加质量分数为5%的富含α−酮戊二酸发酵物有降低小鼠体质量和体质量增加的趋势(图5)。

由图可知，与对照组相比，日粮添加质量分数为5%的富含α−酮戊二酸发酵物能显著增加小鼠的肌肉含量(图6A)及比目鱼肌指数(图6C)，显著降低小鼠的褐色脂肪指数(图6D)，对其他肌肉、脂肪指数无显著影响(图6B、6E、6F)。

2.4 日粮添加富含α−酮戊二酸发酵物对小鼠肠道形态的影响

与对照组相比，日粮添加质量分数为5%的富含α−酮戊二酸发酵物对小鼠回肠和空肠的绒毛长度与隐窝深度无显著影响(图7、图8)。

2.5 日粮添加富含α−酮戊二酸发酵物对小鼠免疫机能的影响

脾脏和胸腺是免疫系统中重要的免疫器官。与对照组相比，日粮添加质量分数为5%的富含α−酮戊二酸发酵物能显著增加小鼠脾脏指数(图9A)，有增加胸腺指数的趋势(图9B)，能显著增加小鼠单核−巨噬细胞的吞噬功能(图9C、9D)。

进一步检测小鼠血象发现，日粮添加质量分数为5%的富含α−酮戊二酸发酵物能显著降低小鼠血液中中性粒细胞百分率，显著提高小鼠血液中淋巴细胞百分率和红细胞平均血红蛋白质量浓度(表1)。

3 讨论与结论 3.1 琥珀酸对枯草芽孢杆菌发酵过程中α−酮戊二酸累积的影响

微生物代谢过程中，代谢酶失活、维生素辅酶缺失或碳氮比例失衡均可以造成特定代谢底物的累积。硫胺素是丙酮酸脱氢酶和α−酮戊二酸脱氢酶的辅因子，因此硫胺素是菌株积累α−酮戊二酸的关键因素^[10]。当硫胺素缺乏时，丙酮酸脱氢酶和α−酮戊二酸脱氢酶的活力就受到了限制，从细胞外流入三羧酸循环中的碳源物质只能部分氧化成丙酮酸和α−酮戊二酸，从而过量积累三羧酸循环中间代谢产物^[11]。此外，还有研究通过控制环境中的碳氮比使α−酮戊二酸得到累积。最早研究发现，在培养基中碳源、氮源含量比例为40∶1~400∶1 时，原核微生物可以利用100 g/L 葡萄糖积累16~17 g/L α−酮戊二酸^[12]。随后也有研究表明，不同的碳氮比会对发酵产物的累积和种类有着重要的影响，过量的碳源和限量的氮源(C∶N=40∶1~400∶1)会使α−酮戊二酸过量累积，低浓度的(NH₄)₂SO₄ 会使菌体的生长受到限制，此时发酵产物主要是柠檬酸而不是α−酮戊二酸。提高(NH₄)₂SO₄浓度以后，此时主要的发酵产物变化为α−酮戊二酸，同时柠檬酸的产量受到限制^[11]。但上述调控措施主要应用于液体发酵，关于固态发酵提高α−酮戊二酸的技术方案尚不明确。本研究发现，在固态发酵过程中，添加琥珀酸可以使α−酮戊二酸得到累积。随着琥珀酸添加量的增加，α−酮戊二酸的产出率逐渐增加，最多可达0.3%。产出率相比液体发酵还有一定的差距，这可能也和高剂量琥珀酸具有一定的抑菌活性有关。而且，我们在发酵产物中没有检测到琥珀酸。这提示外源添加的琥珀酸或已经被菌株彻底代谢利用。

3.2 靶向α−酮戊二酸固态发酵物对小鼠肠道健康的影响

在生产中，有诸多因素(如早期断奶、感染和炎症等)可导致肠道损伤和功能障碍，肠道的不健康会造成动物腹泻、生长缓慢、甚至死亡，导致大量的经济损失^[13-14]。有研究表明，通过营养调节可以改善动物的肠道损伤^[15]。而谷氨酸和谷氨酰胺(α−酮戊二酸的代谢产物)是动物正常采食条件下肠黏膜细胞的主要能量来源，据报道称外源添加α−酮戊二酸可以在许多动物组织中转化为谷氨酸和谷氨酰胺^[16]。此外，α−酮戊二酸氧化提供的大量ATP能调节小肠中的细胞氧化代谢，α−酮戊二酸还可通过肠细胞中的支链氨基酸转氨酶促进支链氨基酸的分解代谢。有大量研究发现，日粮中添加α−酮戊二酸可改善被内毒素攻击仔猪的小肠黏膜形态和功能^[17-18]。肠道绒毛高与隐窝深度的比值升高可增强动物的消化吸收功能，提高动物的生长性能。饲喂α−酮戊二酸固态发酵物后，对小鼠的回肠和空肠进行了HE染色，结果显示，饲喂4周α−酮戊二酸固态发酵物，对小鼠回肠和空肠的绒毛长度与隐窝深度无显著影响。分析其原因可能是固态发酵物所含成分复杂，可能已经存在改善肠道健康的其他代谢物或游离氨基酸。

3.3 靶向α−酮戊二酸固态发酵物对小鼠免疫机能的影响

机体免疫防御受到体内各种生理因素的调节，最近有研究指出，三羧酸循环代谢产物在控制单核细胞或巨噬细胞的表型和效应功能中发挥着重要作用，而特定的巨噬细胞活化或极化状态在功能上决定了对每种代谢物的相对利用。三羧酸循环代谢产物中的α−酮戊二酸是谷氨酰胺和谷氨酸的重要来源，而谷氨酸或谷氨酰胺是巨噬细胞和中性粒细胞的重要原料^[19]，巨噬细胞和中性粒细胞参与机体早期的非特异性免疫反应，α−酮戊二酸作为谷氨酸和谷氨酰胺的前体，对机体的免疫防御发挥着重要作用。本研究发现，饲喂α−酮戊二酸固态发酵物能显著增加小鼠脾脏质量，且有增加胸腺质量的趋势，表明α−酮戊二酸固态发酵物有利于小鼠部分免疫器官的发育。同时小鼠的碳粒廓清试验结果表明，α−酮戊二酸固态发酵物能显著增加小鼠单核−巨噬细胞的吞噬功能。对小鼠的血常规检测也发现，饲喂α−酮戊二酸固态发酵物能显著降低小鼠血液中的中性粒细胞百分率，显著提高小鼠血液中淋巴细胞百分率。综上结果表明，饲喂α−酮戊二酸固态发酵物能够促进小鼠免疫器官的发育，提高小鼠巨噬细胞的吞噬功能，进而提高小鼠的免疫防御功能。

3.4 结论

枯草芽孢杆菌在固态发酵过程中添加质量分数为1% 的琥珀酸可使α−酮戊二酸产出率达到0.3%(w)。日粮添加质量分数为5%的富含α−酮戊二酸发酵物能显著增加小鼠肌肉质量，降低脂肪质量，同时能显著提高小鼠的免疫机能，但是对小鼠肠道形态无显著影响。