2020, Vol. 41
当今世界，社会发展严重依赖以石油为主的化石能源，导致能源、资源、环境危机成为当下制约人类经济可持续发展的主要瓶颈[1]。木质纤维素作为地球上最丰富的可再生资源，通过生物质炼制技术将其转化为可再生的清洁能源成为世界各国科研机构研究的热点[2]。高粱Sorghum bicolor是禾本科Gramineae旱栽作物，是五大粮食作物之一，排在小麦、稻谷、大麦、玉米之后[3]，其光合作用能力强、生长周期短，仅仅3~5个月便可以成熟，耐旱耐盐碱[4]，可作为白酒的优质原料。2016年高粱产量达298.50万t[5]，根据秸秆系数计算法[6-7]，与此同时产生了约388.05万t的高粱秸秆，相当于194.03万t标准煤。对此类生物质能源加以合理利用，通过生物质炼制技术将其转化为沼气或乙醇等清洁能源，必将对解决资源和能源危机以及环保问题做出贡献[8-9]。
木质纤维素原料主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素，实现生物转化的关键是通过预处理破坏其复杂化学结构，脱除木质素，打破其抗降解屏障[10]。预处理技术主要分为物理法、化学法、物理化学综合法和生物法，其中物理法如振荡球磨[11]效率高但能耗也高，设备投入大；化学法如离子液体处理[12]木质纤维素组分损失率小但成本高，污染环境且对后续酶解和发酵有抑制作用；生物法如白腐真菌预处理[13]条件温和、专一性强、能耗低，不会产生环境污染，但是处理时间长、酶活性低；通过将物理和化学法联合起来，以简单的物理预处理和易回收化学药品达到高效降解纤维素、脱除木质素的目的的物理化学综合法成为秸秆预处理的不错选择。预处理低温冻融技术多应用于矿业[14]、路桥[15]、建筑[16]等行业研究中，研究发现低温冻融对于矿体、沥青、钢筋混凝土等物料在微观结构上有较大的破坏。我国北方地区冬季寒冷、资源丰富，其中，作为高粱的主产区，我国东北、华北地区最低月平均气温−10 ℃左右，华北地区平均气温也在−4~0 ℃左右[17]，因此利用我国寒冷地区冷资源成为降低预处理能耗的不错选项。另外，众多研究[18]发现氨水分子可以有效破坏木质素中的C—O—C键、酯键和醚键等化学键[19]，对稻秸中木质素的最大去除率为60%，且处理成本低，易回收[20]。
本文通过模拟自然界的低温环境，结合氨水浸泡预处理，采用低温冻融技术对高粱秸秆进行冻融处理，使秸秆微细结构中的内外游离水结冰后体积膨胀，进而破坏秸秆晶体结构，降解半纤维素和木质素，打破其抗降解屏障，增加后续酶解时酶与纤维素的接触面积，提高酶解效率和还原糖得率，为后续利用酶解产物制备甲烷创造条件。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验材料取自内蒙古自治区赤峰巴林左旗，取材时间为10月中旬，高粱品种为‘绿宝红’，自然风干后用铡刀将高粱秸秆剪切成0.5~1.0 cm的小段，在粉碎机中粉碎，过40目筛后置于烘箱中烘干，80 ℃条件下烘 12 h，测定含水率等理化指标后用密封袋存放于−20 ℃冰箱备用。
试验采用国药集团化学试剂有限公司生产的纤维素酶，活性大于15 U·mg−1。氨水购自南京化学试剂有限公司，氨水质量分数为25%~28%。其他化学试剂均为分析纯。
1.2 试验设备连续投料粉碎机(HCL-5，北京华宏金城商贸有限公司)、温度计(−40 ~300 ℃，深圳市拓尔为电子科技有限公司)、离心机(H1650，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、粗纤维测定仪(FIWE6, VELP)、压片机(YP-2，上海山岳科学仪器有限公司)、X射线衍射仪(X’Pert Pro，荷兰帕纳科公司)、傅里叶红外变换光谱仪[NicoletiS10，赛默飞世尔科技(中国)有限公司]、紫外可见分光光度计[UV2000，尤尼柯(上海)仪器有限公司]。
1.3 试验方法 1.3.1 氨水低温冻融预处理室温下称量10 g高粱秸秆置于250 mL蓝盖瓶中，加入氨水试剂，并用去离子水定容。用温度计对设定温度后的冰箱进行校准，将室温浸泡12 h后的秸秆置入冰箱中进行冷冻处理。冷冻处理结束后自行解冻，置于60 ℃烘箱中烘48 h至恒质量，用自封袋收集样品置于−20 ℃冰箱中保存，便于后续进行成分分析或酶解。
1.3.2 单因素试验设计对浸泡液的液固质量比、冷冻时长、冷冻温度和氨水质量分数进行单因素试验。液固质量比分别为6∶1、8∶1、10∶1和12∶1，冷冻时长分别为0.5、4.0、12.0和24.0 h，冷冻温度分别为−5、−10、−15和−20 ℃，氨水质量分数分别为2%、4%、6%和8%。
1.3.3 正交试验设计在单因素试验基础上选取正交试验因素水平，如表1所示。采用Design-Expert8.0.6 设计L9(34) 正交试验，对高粱秸秆氨水低温冻融预处理条件进行优化。
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表 1 高粱秸秆氨水低温冻融联合预处理正交试验因素与水平 Table 1 Orthogonal test factors and levels of pretreatments of sorghum straw using ammonia water combined with freezing and thawing |
四分法取样后，分别精确称取未处理(CK)和处理过的样品各0.2 g，放入50 mL三角瓶中，按原料质量的10%加入纤维素酶，以pH为4.8的HAc-NaAc缓冲溶液定容，混匀后置于电热恒温水浴箱中，50 ℃条件下反应72 h。所有酶解试验设置3组重复。
还原糖测定采用3,5–二硝基水杨酸法[21]，将反应后的试验样品隔4、12、24、48、72 h各取1次样，将样品冷却至室温后置于10 000 r·min−1的离心机中离心10 min，取上清液测量还原糖浓度。
1.3.5 高粱秸秆成分分析四分法称取未处理和处理的高粱秸秆样品各1 g，采用范式(Van Soest)法[22]对样品的主要成分纤维素、半纤维素、木质素和灰分的含量进行测定。
1.3.6 高粱秸秆物理化学结构特性分析红外光谱分析：将预处理前后的高粱秸秆置于烘箱中干燥，各取3组平行样品，与溴化钾混匀后用玛瑙研钵研磨至白色粉末，用压片机20 MPa条件下压片，后采用傅里叶变换红外光谱仪进行分析，每个样品重复扫描3次，扫描范围400~4 000 cm−1，分辨率4 cm−1。
X射线衍射光谱分析：将预处理前后的高粱秸秆在105 ℃烘箱中干燥4 h至恒质量，用研钵研磨成粉末后在玻片凹槽中均匀压实后扫描。X射线衍射光谱扫描条件为Cu靶，λ=0.154 nm，管压40 kV，电流40 mA，扫描步长0.02 °，扫描角度为2θ，其扫描范围为10~50 °。
纤维素结晶度使用Segal经验法[23]计算：
| $ {\rm{Crl}} = \frac{{{I_{002}} - {I_{{\rm{am}}}}}}{{{I_{{\rm{am}}}}}} \times 100{\text{%}} {\text{，}} $ |
式中：Crl为X射线结晶度；I002为2θ在22°和23°之间衍射强度的最大值；Iam为2θ在18°和19 °之间衍射强度的最小值。
1.4 数据分析采用Excel2019和SPSS21.0软件对酶解试验数据进行统计分析和正交试验分析，采用Origin9.0软件作图，采用t检验比较未处理秸秆和处理过的秸秆的差异。
2 结果与分析 2.1 氨水低温冻融预处理对酶解的影响 2.1.1 单因素试验从图1可以看出，当浸泡液的液固质量比由6∶1增加到10∶1时，秸秆酶解还原糖产量逐渐增加，但液固质量比由10∶1增加到12∶1时，还原糖产量呈下降趋势；冷冻时长由0.5 h增加到4.0 h时，还原糖产量无明显变化，在4.0 h到12.0 h的过程中，还原糖产量开始缓慢增加，而在冷冻时长由12.0 h增加到24.0 h的过程中，还原糖产量增加趋势明显；当冷冻温度从−20 ℃升高到−10 ℃时，还原糖产量下降速率明显，从−10 ℃升高到室温的过程中，还原糖产量下降速率减缓；当氨水质量分数由2 %增加到6 %的过程中，还原糖产量增幅较大，但当氨水质量分数由6 %增加到8 %时，还原糖产量基本保持不变。
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图 1 不同单因素对高粱秸秆酶解还原糖产量的影响 Fig. 1 Effect of different single factor on the yield of reducing sugar by enzymatic hydrolysis of sorghum straw “*”表示与CK差异显著(P<0.05，t检验) “*” indicates significant difference from CK (P<0.05, t test) |
所有单因素试验组的秸秆酶解还原糖产量较未预处理高粱秸秆都显著提高了(P<0.05)。这说明了通过冷冻或者添加氨水都能够提高高粱秸秆纤维素酶的使用效率。说明通过冷冻或者添加氨水预处理高粱秸秆具有可行性，为下一步正交试验提供了依据。
2.1.2 正交试验在单因素试验的基础上选取合适的正交试验因素和水平设计L9(34)正交试验，正交试验结果的直观分析和极差分析见表2。
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表 2 高粱秸秆氨水低温冻融联合预处理正交表及分析结果 Table 2 Orthogonal table and analysis result for pretreatment of sorghum straw using ammonia water combined with freezing and thawing |
由表2可知，预处理的各试验因素对高粱秸秆酶解还原糖产量的影响程度为:氨水质量分数>液固质量比>冷冻温度>冷冻时长，且这4个因素影响都达到了显著(P<0.05)，氨水质量分数对高粱秸秆预处理影响较大。正交试验分析结果表明，理论最优预处理条件为液固质量比12∶1，冷冻时长4.0 h，冷冻温度−10 ℃，氨水质量分数8%，该条件下理论秸秆酶解还原糖产量为269.77 mg·g−1。各试验组酶解还原糖产量相较于未进行预处理秸秆的酶解还原糖产量(167.94 mg·g−1)提高了33.6%~80.34%，差异显著(P <0.05)，且试验最优预处理条件为液固质量比12∶1，冷冻时长12.0 h，冷冻温度−10 ℃，氨水质量分数8 %，酶解还原糖产量为302.87 mg·g −1，较未预处理组还原糖产量提高了80.34%。理论最优预处理条件下酶解还原糖产量相比于试验最优酶解还原糖产量降低了12.27%，说明了冷冻时长增加，游离态的水分子对于秸秆微结构的破坏作用更明显，而冷冻时长减少会降低冷冻对于秸秆的预处理效果。因此，将液固质量比12∶1，冷冻时长12.0 h，冷冻温度−10 ℃，氨水质量分数8%作为最优预处理条件。
2.2 氨水低温冻融预处理对秸秆化学成分的影响使用范式法分别测定未处理的高粱秸秆与试验最优预处理高粱秸秆成分，结果如表3所示。由表3可以看出，经氨水低温冻融预处理后，高粱秸秆纤维素含量下降8.05%，半纤维素含量下降42.42%，木质素含量下降50.76%，灰分含量上升2.06%。在物理结构层面，氨分子渗透到高粱秸秆的纤维结构中使得秸秆微细结构膨胀，增加了生物质表面积[24]，经低温冷冻后，秸秆内外游离水结冰使得秸秆微细结构进一步膨胀[25]；在化学结构层面，氨选择性地与木质素的C—O—C键、酯键和醚键等发生化学反应[16]，这也是木质素得到有效去除的主要原因。综上，氨水低温冻融预处理对高粱秸秆的化学成分作用明显，为酶解产还原性糖提供了较好的条件。
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表 3 氨水低温冻融联合预处理对高粱秸秆成分变化的影响 Table 3 Influence of pretreatment using ammonia water combined with freezing and thawing on compositional change of sorghum straw |
傅里叶红外变换光谱可以对木质纤维原料进行扫描，通过对比高粱秸秆预处理前后的谱图，准确分析秸秆化学结构的变化。由图2可见，氨水低温冻融预处理前后除某些特征峰的消失或吸收强度的变化外，红外吸收峰形状基本相同。经过氨水低温冻融联合预处理后，波数830 cm−1处C—H弯曲振动增强，899 cm−1处的β–1,4糖苷键振动吸收峰[26]增强，表明秸秆中的聚糖降解，官能团更充分地暴露出来。与未处理秸秆相比，波数1 050 cm−1处的C—O和—CH2的伸缩振动吸收峰[27]经预处理后明显上升，说明了氨水低温冻融联合预处理能够使晶体结构遭到有效破坏，从而使纤维素聚合度下降。波数1 250 cm−1处的谱峰为乙酰脂键、酚类C—O振动和—OH的变形振动[28]，经预处理后在该处的峰明显减弱，这说明部分半纤维素和木质素得到有效降解。波数1 380和1 610 cm−1处小峰和宽峰均为木质纤维素中的COO−1对称伸缩振动吸收特征峰，与未处理秸秆的谱图相比，经预处理后在该处附近的峰明显增强，这是预处理对木质纤维素的结构进行有效破坏的结果。波数1 510 cm−1处的谱峰为木质素振动吸收峰，此处吸收峰主要为—CH2、C—O和苯环中的C—C，表明在预处理过程中部分木质素聚合体被破坏，聚合度下降。波数1 730 cm−1处的单肩谱峰是COOH上的C=O键的伸缩振动吸收峰[29]，与未处理秸秆的谱图比，预处理后该处谱峰基本消失，这表明了预处理使半纤维素中酯键发生了断裂，半纤维素降解。波数2 920 cm−1处为木质纤维素结构中的—CH、—CH2的对称和不对称伸缩振动吸收峰。波数3 400 cm−1处为木质纤维素中酚羟基—OH的振动吸收峰，与未处理秸秆的图谱相比，经氨水低温冻融预处理后破坏了木质纤维素的氢键，并有酚羟基或脂肪族羟基产生。
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图 2 高粱秸秆氨水低温冻融联合预处理前后傅里叶红外光谱图 Fig. 2 Fourier infrared spectra of sorghum straw before and after pretreatment using ammonia water combined with freezing and thawing |
红外光谱图分析结果表明，氨水低温冻融联合预处理对高粱秸秆木质纤维素之间的氢键进行了有效破坏，部分半纤维素因C=O键断开而溶解；同时，高粱秸秆中木质素的—CH2、C—O，苯环中C—C键充分暴露出来，对木质素的单体和聚合结构均有一定程度的破坏；纤维素中的β–1,4糖苷键、—CH2和—OH原有连接结构被打破。预处理前后的化学结构特性变化有效破坏了高粱秸秆的抗降解屏障，提高了纤维素酶对秸秆微观结构的可及度，降低了传质阻力，提高了酶解效率和还原糖得率。
2.4 氨水低温冻融预处理对秸秆结晶度的影响木质纤维原料的主要组分是纤维素，纤维素按不同尺度结构单元在空间的相对排列位置及形态特征分为链结构和聚集态结构，是一种高分子化合物，在聚集态中具有晶体、非晶体、取向态和液晶4种结构[3]。结晶度是表征纤维素超分子结构的重要参数，采用X射线衍射法可以准确测定秸秆的纤维素结晶度。诸多研究[30-32]表明，纤维素的结晶度与纤维素酶的酶解效率密切相关。
图3是未处理原料和氨水低温冻融联合预处理后的X射线衍射图谱。如图3所示，试验最优预处理和未处理的衍射峰在16.0 °附近的峰型基本一致，但试验最优预处理样品的衍射强度明显减弱。试验最优预处理组在2θ=18.0 °的波谷较未处理组位置向左偏移，这表明纤维素无定形区单体结构产生变化。在2θ=22.0 °处出现明显的衍射强度单峰，预处理后样品衍射峰强度显著增强，根据公式计算出未处理组纤维素结晶度为24.36%，试验最优预处理后秸秆纤维素的结晶度为38.25%，提高了57.02%，这表明高粱秸秆在预处理后，半纤维素和木质素2种无定形区降解溶出并暴露在外，纤维素相对含量增加并导致纤维素基质的部分重结晶，纤维结构发生重排，原料的有序结构受到破坏，部分结晶区变为无定形区且有少量结晶生成或结晶重定向，使该衍射角度下吸收强度大幅增加，这与红外光谱图中1 050、1 380和2 920 cm−1处的木质纤维素化学基团的吸收峰增强相对应。由图可以看到试验最优预处理后在2θ=28.0、30.5和34.5 °处的衍射峰相较于未处理组基本消失，这表明氨水低温冻融联合预处理使纤维素的结晶结构产生显著变化。
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图 3 高粱秸秆氨水低温冻融联合预处理前后X射线衍射图谱 Fig. 3 X-ray diffraction pattern of sorghum straw before and after pretreatment using ammonia water combined with freezing and thawing |
X射线衍射分析结果表明，氨水低温冻融联合预处理对秸秆的纤维素结晶度有双重作用，一方面经过预处理破坏纤维素结晶区的氢键降低了结晶度，但与此同时无定形区木质素的去除和半纤维素的溶解使总体的结晶度大于对结晶区的破坏而升高，这与Kim等[30]采用氨水、陈尚钘等[31]采用稀酸、Pang等[32]采用微波蒸汽联合预处理玉米秸秆时均发现了预处理使秸秆纤维素结晶度上升或者具有双重作用的事实一致。
3 讨论与结论高粱秸秆经氨水低温冻融联合预处理的最优预处理条件为浸泡液的液固质量比12∶1，冷冻时长12.0 h，冷冻温度−10 ℃，氨水质量分数8%，其中氨水质量分数对处理作用效果最明显。预处理后的高粱秸秆干物质经纤维素酶解，其还原糖产量为302.87 mg·g−1，是未进行预处理秸秆的1.8倍。在最优预处理条件下，半纤维素的去除率为42.42%，木质素去除率为50.76%，还原糖得率为30.29%，还原糖产量优于Yang等[33]应用γ射线和机械粉碎结合预处理小麦酶解的10.24%还原糖得率。
对高粱秸秆进行预处理前后的化学成分变化分析可以得出，氨水低温冻融预处理虽然没有对高粱秸秆的纤维素造成明显破坏，但对高粱秸秆中半纤维素和木质素的去除作用显著，氨水低温冻融预处理对高粱秸秆的物理结构和化学结构2个层面都有积极的破坏作用。
红外光谱分析结果表明经氨水低温冻融联合预处理后有效破坏了高粱秸秆木质纤维素间的氢键，纤维素原有连接结构被打破，部分半纤维素溶解，木质素的单体和聚合结构被破坏，有效降低了高粱秸秆的抗降解屏障，降低了传质阻力，提高了酶解效率和还原糖得率。
X射线衍射分析结果表明，高粱秸秆经氨水低温冻融联合预处理后，纤维素结晶度提高了13.89%。从结晶区和无定形区的累积衍射强度看，该预处理方法对木质纤维素的结晶度有积极影响。
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