美国农业部2020年6月发布2020—2021年度全球玉米产量预估报告，我国以2.6亿t的预估产量位居全球第2。玉米作为我国主要农作物之一，是我国重要的经济产业，其种子质量直接影响玉米产量，其中种子发芽率是评价种子质量的重要指标之一^[1]。为避免因种子发芽率过低导致产量受损，需在播种前对随机抽取的玉米种子进行发芽试验以确定发芽率，但该方法耗时较长且受休眠期影响。为缩短检测时间，染色法代替了发芽试验法，有活力种子胚细胞中的脱氢酶被染色剂(TTC)还原，胚部位呈红色，以此区分有无活力的种子。染色法简单快速、准确可靠，同时适用于休眠期长和难以进行发芽试验的种子，但仍为有损检测且对操作者专业性要求较高^[2]。因此，1995年国际种子检验协会的《种子生活力测定手册》提出电导率检测方法^[3]，在保证检测速度的同时，降低了对操作人员的要求，但其主要基于种子吸胀初期细胞膜损伤重建过程中电解质和可溶性物质的外渗程度，对种子发芽率进行评价，耗时较长且损伤种子，同时准确性也易受室温、水温、水质等因素影响。

为实现玉米种子发芽率的快速无损检测，近年来，机器视觉、近红外光谱、高光谱成像等多种无损检测技术被应用于种子质量评价。为准确检测玉米种子是否有机械损伤裂纹，闫彬等^[4]基于机器视觉技术对自动提取的320幅玉米胚面和胚乳面图像裂纹进行识别，准确率分别为94.4%和86.9%。Kusumaningrum等^[5]采用近红外光谱技术并结合偏最小二乘法判别区分有无活力的大豆种子，精确度接近100％。Kimuli等^[6]采用可见/近红外高光谱成像系统对不同地区的4个品种的玉米种子表面是否含黄曲霉毒素B1进行评估，结合主成分分析和因子判别分析建模，评估准确率达到96%。Feng等^[7]利用高光谱成像技术，通过图谱融合鉴定不同加速老化时期的玉米种子活力，通过发芽试验验证分类模型，其结果表明，高光谱技术结合SVM模型可以进一步提高玉米种子活力的检测精度。可见，检测信息维度的增加有利于提高检测精度。本文拟通过深度扫描光声光谱技术将光谱技术拓展到光谱、声音、深度维度，基于此，构建玉米种子发芽率预测模型，实现对不同颜色玉米种子发芽率的快速、无损、高精度检测，为种子质量评估提供新的方法和技术。

1 材料与方法 1.1 试验材料

选取3种颜色、6个品种的玉米种子为研究对象，其中每种颜色的玉米种子均有2个不同的品种，分别为白玉米(‘银香’和‘京糯808’)，黄玉米(‘京黏1号’和‘苏玉’)，黑玉米(‘黑糯4号’和‘黑糯6号’)，于2019年收获于山东潍坊，由寿光顺昌种业提供，经筛选剔除缺陷种子，每个品种挑选颗粒饱满、外表无明显差异的种子1 600粒，用于人工老化。

1.2 人工老化

为得到不同发芽率的玉米种子，参照已有研究^[8]采用人工老化法对玉米种子样品进行高温高湿人工老化处理。将挑选的种子均分为8份，按照0~7次序编号，将0~7号样品置于托盘中放入培养箱(宁波江南仪器厂制造，型号：RXZ-128A)在温度45 ℃和相对湿度95%环境下分别老化0、1、2、3、4、5、6和7 d。结束后从培养箱中取出，自然条件下风干1 d后装入密封袋中，放入4 ℃冰箱冷藏保存。

1.3 检测原理

光声光谱技术(Photoacoustic spectrometry technology, PAS)是一种基于光热测量原理的新型技术，与传统吸收光谱的测量原理差异在于，PAS并非基于光子特性直接进行光谱检测，而是在样品受光照之后，对其在无辐射激发现象中的周期性热流进行检测。在不同光谱波长和调制频率下，不同材料中的热扩散长度具有差异，因此，可通过物质表面附近热扩散层内的光吸收进行物质成分分析。随着调制频率的降低，热扩散距离增加，检测深度更深，基于此原理可以检测样品不同深度的物质成分^[9]。由于玉米种子的种皮具有良好的透光性，而胚乳、子叶、胚芽、胚轴和胚根的老化程度和种子生命活力具有密切的联系，因此通过深度扫描光声光谱可挖掘出玉米种子的生命信息^[10]，原理如图1所示。

1.4 光声光谱采集

试验使用美国Thermal Fish公司生产的Nicolet Is50R 红外光谱仪和美国MTEC Photoacoustics公司生产的PA300光声检测器搭建玉米种子光声光谱检测系统。在试验数据采集之前，将光谱仪开机预热0.5 h，并用氮气对整个红外光谱仪仓体内部进行吹扫，以减小水分对光谱测定的干扰，然后对光谱仪进行设定。试验过程中扫描的光声光谱波数范围为中红外400~4 000 cm⁻¹，光谱扫描的分辨率为8 cm⁻¹，动镜速率为0.32 cm/s，光谱的连续扫描次数为32次。把不同老化程度的玉米样品以单颗形式均匀放置在铜质圆柱形样品池(直径10 mm，高5 mm)中，调整样品的高度，使其低于样品仓边缘1~2 mm，用氦气 (5 mL·min⁻¹)连续吹扫10 s后采集样品的光声光谱，每改变一次采集深度前需重新用玻璃碳进行一次相位校准，以碳黑背景光谱作为对照，用于光谱信号的标准化处理。检测装置如图2所示。

1.5 发芽试验

经过人工加速老化处理和光谱采集后，取不同老化处理时间的玉米种子各200粒，均分为4组，进行发芽试验。试验过程中首先将不同老化时间的玉米种子按编号放入装有清水的500 mL烧杯中，在20 ℃恒温条件下浸种48 h。然后，将不同老化时间的玉米种子按编号顺序依次放置在内铺2层滤纸的玻璃培养皿的相应位置，加水湿润，每粒玉米种子之间留有种子直径5倍以上的间距，盖好盖子后放入20 ℃的智能人工气候箱(型号：RXZ型-多段编程，宁波江南仪器厂)中，按照GB/T 3543.4—1995农作物种子检验规程 发芽试验^[11]要求培养玉米种子7 d。每天记录玉米种子的发芽情况，第7天计算发芽率，结果取4组试验的平均值。发芽率试验结果见表1。

2 结果与分析 2.1 EEMD去噪

通过集合经验模态分解(Ensemble empirical mode decomposition, EEMD)对采集到的原始光谱信息进行去噪，得到平滑的原始光谱曲线^[12]。步骤如下：

1)在原始光谱曲线 $x(t)$ 中引入正态分布的白噪声 $w(t)$ ；

2)加入白噪声的光谱作为一个新的光谱曲线 $X(t) = x(t) + w(t)$ ，对构造的新光谱曲线 $X(t)$ 进行经验模态分解，得到各个本征模函数(Intrinsic mode function, IMF)分量：

$X(t) = \sum\limits_{j = 1}^n {{c_j} + } {r_n},$

(1)

式中， ${c_j}$ 是经验模态分解得到的第 $j$ 个IMF， ${r_n}$ 是分解删除 $n$ 个IMF后的残余分量，常表示信号趋势；

3)给原始光谱曲线 $x(t)$ 加入不同的白噪声 ${w_i}(t)$ ，重复以上步骤得到各自分解后的IMF分量组：

$X(i) = \sum\limits_{j = 1}^n {{c_{ij}} + {r_{in}}} ,$

(2)

式中， $X(i)$ 是加入白噪声 ${w_i}(t)$ 后的光谱， ${c_{ij}}$ 是经验模态分解得到的第 $j$ 个IMF， ${r_{in}}$ 是分解删除 $n$ 个IMF后的残余分量；

4)每次获得的IMF集合平均后作为最终的IMF：

${c_j} = \sum\limits_{i = 1}^N {{c_{ij}}/N} ,$

(3)

式中， $N$ 为添加噪声的次数。

以‘京黏1号’玉米为例，由于Nicolet Is50R 红外光谱仪的测量波数范围(4 000~3 700 cm⁻¹和940~400 cm⁻¹)内的信噪比过低，因此去除该段波数。图3为该玉米种子在调制频率为500 Hz下的光声光谱原始图像和EEMD去噪图像。

由图4可见，不同老化程度的玉米种子在波数3 700~940 cm⁻¹之间具有相似的吸收特性，出现相似度较强的吸收峰。在波数3 500~3 100 cm⁻¹处有较宽吸收峰；在波数3 000~2 850 cm⁻¹处均出现一尖峰；在2 700~1 850 cm⁻¹范围内，光声光谱信号较平缓，仅在2 320 cm⁻¹处出现一小峰；在波数1 630 cm⁻¹处有较明显尖峰；在波数1 500~1 200 cm⁻¹处有一段平缓且不明显小峰；在波数1 440~1 317 cm⁻¹处亦然，在1 412 cm⁻¹附近有一吸收峰；指纹区1 060 cm⁻¹附近有一强而宽的吸收峰；以上吸收峰均反映了玉米种子内部成分的光声光谱特性。

2.2 PCA特征波长提取

主成分分析(Principal component analysis, PCA)旨在实现数据降维，消除众多信息相互重叠的部分^[13]。本文对已经预处理过的每个深度的样本进行主成分分析，经过预处理之后，每条玉米种子光声光谱有727个数据点，各检测深度的玉米种子光谱信息组成数据矩阵。虽均可作为模型的输入，但大量的数据会显著增加计算量，同时信息冗余也会导致过拟合而降低模型的预测精度，因此利用主成分分析分别获取各检测深度数据矩阵的主成分及相应贡献率，以95%为目标累积贡献率选取主成分，完成光声光谱的特征提取，特征光谱如图5。

2.3 玉米发芽率检测模型的建立与验证

为优化玉米光声光谱发芽率预测模型，分别采用偏最小二乘法回归(Partial least squares regression, PLSR)、BP神经网络(Back propagation neural network, BPNN)、支持向量回归(Support vector regression, SVR)和广义回归神经网络(Generalized regression neural network, GRNN) 4种建模方法，在7个检测斩波频率下建立28种玉米种子发芽率预测模型。各检测斩波频率以3︰1为比例随机选出训练集和预测集，将特征光谱作为模型输入，玉米种子发芽率作为模型输出，建模结果对比见表2和表3。

由表2可见，‘京黏1号’玉米在不同深度下的SVR建模结果均较优，BP、PLSR和GRNN模型在不同深度下的结果优劣各异，且稳定性较差。综合建模精度和采样时间两方面因素，选定500 Hz为最优检测频率，该频率下训练集和预测集的相关系数较高，且相对偏差较小。其余5个品种玉米的发芽率预测模型建立结果与‘京黏1号’趋势相同，均在500 Hz调制频率下SVR预测结果最优。

表3为6个品种玉米种子以最优模型(SVR模型)独立、混合建模的结果。由表3可见，训练集和预测集的相关系数较高，且相对偏差较小，表明SVR建模方法对单一品种玉米种子和多品种混合玉米种子的发芽率预测均适用，且不受玉米表面颜色影响。同时，混合建模时，训练集相关系数为0.994 5，均方根误差为0.974 8，预测集相关系数为0.942 1，均方根误差为1.387 8，虽然建模效果评定为优良，但精度较单一品种玉米种子建模精度相比略低。单一品种玉米和混合玉米发芽率的SVR预测模型见图6。

3 讨论与结论

基于不同老化时间玉米膜结构完整性差异、玉米种子内部物质发生变化的生物学原理及光声光谱检测的物理学原理对玉米发芽率进行预测。已有生物学分析^[14-15]表明：随着玉米种子老化劣变，玉米种子发芽率降低，其内部酶基团(主要元素：C、H、O、N)的活性也逐渐降低，如玉米内部的过氧化物酶、脱氢酶、过氧化氢酶等；同时，可溶性糖(主要元素：C、H、O)和丙二醛(主要元素：C、H、O)含量逐渐增加，可溶性蛋白(主要元素：C、H、O、N、S等)含量不断减少。光声光谱检测技术能够通过对光转换成声的能力大小的探测来确定物质的热学性质和光谱学性质，改变调制频率便可获取玉米种子不同深度下物质变化的信息。

在500 Hz时，玉米种子的生物学变化最为敏感，其中：可溶性糖和蛋白质等C—O键、C—N键的伸缩振动导致波数1 160~1 000 cm⁻¹的波段内出现吸收峰；油脂和纤维素等C—O键和C—C键的伸缩振动导致波数1 060 cm⁻¹附近强而宽的吸收峰；波数1 412 cm⁻¹附近的吸收峰为淀粉中C—O—O、CH₂伸缩振动吸收区；波数1 440~1 317 cm⁻¹附近的吸收峰为亚甲基和甲基对称弯曲振动及CH₃剪式振动吸收；波数1500~1200 cm⁻¹范围内的吸收峰是多糖和蛋白质混合振动的吸收区；波数1 630 cm⁻¹处小的吸收峰主要由蛋白质C—O键的伸缩振动(酰胺I)和水的O—H键的弯曲振动以及不饱和油脂中C—C键的伸缩振动叠加而导致；波数2 320 cm⁻¹处的小吸收峰由光声池中残余CO₂气体导致；波数3 000~2 850 cm⁻¹处的尖状吸收峰主要为丙二醛和纤维素等物质的C—H键伸缩振动所导致；波数3 500~3 100 cm⁻¹处宽的吸收峰主要由水中O—H键和蛋白质中N—H键振动伸缩的叠加作用导致^[16-18]。

本文采用基于深度扫描的单粒玉米发芽率光声光谱检测方法，采集3种颜色、6个品种的不同老化程度的玉米种子在不同调制频率下的光声光谱信息，通过EEMD和PCA对原始光声光谱进行去噪和降维处理，分别结合PLSR、BPNN、GRNN和SVR进行建模。结果表明，500 Hz为最佳扫描频率，SVR建模为最优发芽率预测模型；单一品种玉米种子发芽率预测相关系数均超过0.980 0，混合品种玉米种子发芽率预测相关系数达0.942 1。结果表明，光声光谱深度扫描技术通过拓展光谱、声音和深度信息预测玉米种子发芽率是可行的，可为多维、高精度检测种子发芽率提供新方法。