2021, Vol. 42
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)感染引起的一种急性、烈性传染病，家养和野生型的猪、牛、羊等偶蹄动物是该病常见的易感动物[1]。该病被国际动物卫生组织(OIE)列为世界上最重要的动物疾病之一[2]。FMD典型的临床症状包括发烧和口腔黏膜、乳部皮肤、蹄叉蹄踵等部位出现不同程度的水泡及烂斑[3]。自Loeffler等[4]在1897年发现FMD以来，全球养殖业便不断受到其影响。该病流行范围广、发病率高、破坏力强，已成为目前世界动物产品贸易最重要的障碍之一[5]。
FMDV属于小RNA病毒科Picornaviridae口疮病毒属Aphthovirus，小而无囊膜，分为7个不同的血清型，即O、A、C、SAT 1、SAT 2、SAT 3和Asia 1[6]，其中，O型是目前全球流行范围最广的血清型[7]。FMDV颗粒由1个二十面体的外壳组成，该外壳包含4个结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和8个非结构蛋白[8-9]。其中，结构蛋白VP1的第140~160位氨基酸处具有1个突出的环结构，称为G-H环[10]，该环具有的RGD结合位点可与易感细胞表面的整合素受体分子相结合，已被鉴定为是引发机体产生中和抗体的主要免疫原性位点[11-12]。VP1还具有一个天然的优势是其同时存在T细胞表位(第16~44位氨基酸)和B细胞表位(第141~160位氨基酸和第200~213位氨基酸)，这些表位已被证实可被动物机体识别并诱导机体产生良好的免疫反应[13-15]。
近十年来，我国流行的FMDV以A型和O型为主，预防监测和免疫扑杀是我国目前防控FMD的主要手段[16]。疫苗免疫是防控FMD的常见手段，当前预防FMD最有效的商业疫苗是用二乙烯亚胺(Binary ethylenimine，BEI)灭活的疫苗[17]。然而，传统的灭活疫苗存在一些不可避免的缺点，如热稳定性较差、需要冷链运输、免疫持续期短等[18]。随着现代分子生物学和免疫学技术的不断进展，以及全球猪肉贸易的日趋频繁，FMD疫苗已逐渐从灭活疫苗、弱毒疫苗等传统疫苗向合成肽疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗和可饲疫苗等新型疫苗的方向发展，研制新型FMD疫苗逐渐成为当前研究的热点[19]。信号肽对蛋白的分泌有着积极的作用，Stern等[20]研究发现高斯荧光素酶(Gaussia luciferase)信号肽有很强的外源蛋白分泌能力。本研究以猪O型FMDV VP1基因序列为基础，重复串联该片段中的T、B细胞表位基因，并引入高斯荧光素酶信号肽序列，设计合成重组基因RP1，表达包含FMDV抗原表位与结构蛋白VP1的融合蛋白，并将表达后的融合蛋白与佐剂等体积混合制成亚单位疫苗。疫苗免疫小鼠后能有效刺激小鼠机体产生免疫应答反应，为FMD的防控提供了参考。
1 材料与方法 1.1 菌株、载体与试验动物人胚肾上皮细胞(HEK-293T)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1细胞)、大肠埃希菌DH5α感受态细胞、表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro和辅助质粒PLP1、PLP2、PLP3均由华南农业大学兽医学院微生物学与免疫学教研室保存。
1.2 主要试剂DMEM高糖培养基、F-12K培养基、0.25%(w)胰酶消化液购自美国Thermo Fisher公司；限制性内切酶EcoR I、BamH I购自宝生物工程(大连)有限公司；T4 DNA连接酶、转染试剂Lipofectamine 3000购自美国Thermo Fisher公司；胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒等购自美国Omega Bio-Tek公司；鼠源His标签单克隆抗体(MAb)、鼠源GAPDH MAb、HRP标记山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)、FITC标记山羊抗小鼠IgG等购自上海碧云天生物技术有限公司；FMDV VPI Mab由华南农业大学兽医学院微生物学与免疫学教研室保存；甘氨酸、甲醇、Tris base、NaCl和KCl等化学试剂购自广州豪凯生物技术有限公司；FMDV灭活疫苗Re-O/MYA98/JSCZ/2013株购自金宇保灵生物药品有限公司；FMDV O型IgG抗体检测试剂盒购自深圳芬德生物技术有限公司。
1.3 重组基因RP1的设计与合成参照GenBank中登录的猪O型FMDV全基因核苷酸序列(JN998085.1)，筛选获得VP1基因序列；以-GG-、-GGSSGG-作为linker将该片段中的T细胞表位和B细胞表位(表1)串联在VP1片段的首尾两端，同时在N端引入高斯荧光素酶信号肽序列，在C端引入His标签序列，设计合成重组基因RP1(图1)。根据合成的RP1基因全序列设计1对引物RP1-F1/RP1-R1，分别在该引物中引入EcoR I和BamH I酶切位点，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列为RP1-F1：5′-CG GAATTCGCTACCATGGGAGTGAAGGTGCT-3′，RP1-R1：5′-CG GGATCCTCAGTGGTGGTGATGGTGGTGAGGGGTCA-3′(下划线处为酶切位点)。
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表 1 表位肽序列及位置 Table 1 Sequence and position of epitope peptides |
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图 1 重组基因RP1多表位串联模式图 Fig. 1 Multi-epitope tandem pattern map of recombinant gene RP1 |
以人工合成的RP1全基因序列为模板，利用引物RP1-F1/RP1-R1扩增含有酶切位点的目的基因。扩增参数为98 ℃ 2 min；98 ℃ 30 s，65 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 7 min。对PCR产物回收纯化后通过双酶切将RP1基因克隆到表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro中，将经PCR及双酶切鉴定后的重组质粒命名为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1。
1.5 重组慢病毒的制备按照Lipofectamine 3000试剂盒说明书操作，将转染试剂与1 000 ng的重组质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1和适量的辅助质粒PLP1、PLP2、PLP3完全混匀，室温孵育15 min后转染6孔细胞板中的HEK-293T细胞，6 h后更换成含2%(φ)胎牛血清的DMEM培养基，连续培养48 h即获得重组慢病毒HIV-RPI。
1.6 重组细胞CHO-K1-RP1的构建与鉴定当CHO-K1细胞在直径为6 cm的培养皿中贴壁生长至占60%皿底面积左右的数量时，加入收获的重组慢病毒，并添加24 μg聚凝胺促进病毒吸附。待细胞长满后添加32 μg嘌呤霉素筛选慢病毒是否感染成功。提取筛选后生长状态良好的细胞总RNA，反转录为cDNA后作为模板，利用引物RP1-F1/RP1-R1 进行PCR扩增，产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。另将筛选的重组细胞铺满96孔细胞板，用预冷的PBS缓冲液洗涤后固定细胞。向各孔中加入鼠源His标签MAb(用PBST缓冲液按照体积比1︰200稀释)为一抗，FITC标记的山羊抗小鼠IgG(用PBST缓冲液按照体积比1︰300稀释)为二抗，进行间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay，IFA)鉴定，观察融合蛋白的表达情况。将鉴定正确的重组细胞命名为CHO-K1-RP1。
1.7 CHO-K1-RP1单克隆细胞株的筛选与鉴定取适量筛选的重组细胞CHO-K1-RP1计数，采用有限稀释法并按照每孔0.5个细胞的量铺满96孔板，筛选单克隆细胞株。观察各孔细胞的生长状况，弃去没有细胞的孔和存在多个单克隆细胞团的孔，并做好标记。将筛选的单克隆细胞株扩大培养后以鼠源His标签MAb(用PBST缓冲液按照体积比1︰200稀释)为一抗，FITC标记的山羊抗小鼠IgG(用PBST缓冲液按照体积比1︰300稀释)为二抗进行IFA检测融合蛋白的表达。将表达量较高的单克隆细胞株传至30代，每隔5代收获相同数量的细胞样品，以FMDV VP1 MAb(用PBST缓冲液按照体积比1︰1 000稀释)、鼠源GAPDH MAb(用PBST缓冲液按照体积比1︰1 000稀释)为一抗，再以HRP标记的山羊抗小鼠IgG(用PBST缓冲液按照体积比1︰1 000稀释)为二抗对收集到的细胞样品进行Western blot检测，分析筛选的单克隆细胞株中融合蛋白RP1的稳定表达情况。
1.8 融合蛋白的制备与鉴定将筛选的单克隆细胞株悬浮驯化培养，取适量悬浮培养的细胞，低速离心后弃上清液，细胞沉淀经PBS缓冲液重新悬浮后通过超声波裂解，4 ℃条件下以最大转速离心，收集上清液，即为获得的融合蛋白样品，将样品置于−80 ℃保存。以鼠源His标签MAb(用PBST缓冲液按照体积比1︰1 000稀释)、鼠源GAPDH MAb(用PBST缓冲液按照体积比1︰1 000稀释)为一抗，再以HRP标记的山羊抗小鼠IgG(用PBST缓冲液按照体积比1︰1 000稀释)为二抗，将制备的蛋白样品及已知浓度的His标签蛋白按照预定顺序进行SDS-PAGE凝胶电泳及Western blot检测，并通过ImageJ软件进行灰度值分析，计算融合蛋白的质量浓度。
1.9 重组亚单位疫苗的制备根据“1.8”计算所得的重组蛋白质量浓度，将表达的重组蛋白稀释为80 µg/mL，并将其与ISA 201 VG佐剂按1︰1的体积比混合乳化，制备终质量浓度为40 µg/mL的重组亚单位疫苗，4 ℃保存备用。
1.10 小鼠免疫及抗体效价的测定将30只4~6周龄的SPF级BALB/c小鼠随机分为3组(I~III组)，每组10只。第I组接种制备的重组亚单位疫苗，第II组接种FMD商品化灭活疫苗，第III组接种PBS缓冲液作为对照，每只小鼠的免疫剂量均为200 µL。每次免疫间隔2周，共免疫3次，均采用皮下多点注射方式接种。分别在一次、二次和三次免疫后7 d经尾静脉采血，分离血清，利用ELISA抗体检测试剂盒检测小鼠血清特异性抗体。
2 结果与分析 2.1 重组质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1的构建与鉴定由图2可知，以构建的重组质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1为模板，利用引物RP1-F1/RP1-R1扩增出约1 500 bp的目的条带，与目的基因片段大小相符；双酶切重组质粒后，在约1 500 bp处有一特异性条带，与目的基因大小一致，表明正确构建了重组质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1。
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图 2 重组质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1的鉴定结果 Fig. 2 Identification result of recombinant plasmid pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1 M1：DL2000 DNA marker，M2：DL15000 DNA marker，M3：DL2000 DNA marker，1：EcoR I酶切产物pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1，2：BamH I酶切产物pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1；3：目的基因RP1 M1: DL2000 DNA marker, M2: DL15000 DNA marker, M3: DL2000 DNA marker, 1: Digested product of pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1 by EcoR I, 2: Digested product of pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1 by BamH I, 3: Target gene RP1 |
提取重组细胞CHO-K1-RP1的总RNA进行反转录，以反转录产物为模板，用特异性引物RP1-F1/RP1-R1进行扩增，结果显示在约1 500 bp处有目的条带(图3)，与预期相符。表明在转录水平上检测到重组细胞CHO-K1-RP1中RP1基因的表达。
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图 3 重组细胞CHO-K1-RP1的RT-PCR鉴定结果 Fig. 3 Identification result of recombinant cell CHO-K1-RP1 by RT-PCR M：DL2000 DNA marker；1、2：RP1基因；3：空白对照 M: DL2000 DNA marker; 1, 2: RP1 gene; 3: Blank control |
将筛选的CHO-K1-RP1单克隆细胞扩大培养，通过IFA及Western blot鉴定重组基因RP1的表达。IFA结果显示，部分单克隆细胞株可发出绿色荧光，而对照细胞无绿色荧光(图4)；Western blot结果显示，不同代次细胞样品均能在55 kU处观察到特异性条带(图5)。表明筛选获得的部分CHO-K1-RP1单克隆细胞株可稳定表达融合蛋白RP1。
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图 4 单克隆细胞株的间接免疫荧光试验鉴定 Fig. 4 Indirect immunofluorescence assay identification of monoclonal cell line a~o：部分阳性单克隆细胞系；p：空白对照；标尺=20 μm a−o: Partially positive monoclonal cell lines; p: Blank control; Bar=20 μm |
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图 5 融合蛋白在不同代次细胞中表达的鉴定 Fig. 5 Identification of the expression of fusion protein in different generations of cells CK：空白对照 Blank control |
收集扩大培养的单克隆细胞株样品，通过Western blot进行鉴定，使用ImageJ软件对所得条带进行灰度值分析。结果显示，部分细胞样品在约55 kU处出现特异性条带(图6)，与预期蛋白分子量大小相符；与空白对照细胞相比，不同细胞株融合蛋白的表达量有显著差异(图7)；表明该单克隆细胞株可成功表达融合蛋白RP1。挑选表达量最高的样品，使用ImageJ软件对其条带(图8)进行灰度值分析后测得融合蛋白的质量浓度最高可达110 µg/mL。
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图 6 单克隆细胞株的Western blot 鉴定 Fig. 6 Western blot identification of monoclonal cell line M：蛋白分子量标准；1~32：不同单克隆细胞株；CK：空白对照 M: Protein molecular weight standard; 1−32: Different monoclonal cell lines; CK: Blank control |
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图 7 不同单克隆细胞株融合蛋白的相对表达量 Fig. 7 Relative expression levels of fusion protein in different monoclonal cell lines 1~32：不同单克隆细胞株；“*”、“**”和“***”分别表示细胞株和空白对照在 P<0.05、P<0.01 和 P<0.001 水平差异显著 (单因素方差分析) 1−32: Different monoclonal cell lines; “*”, “**” and “***” indicate significant differences between the cell line and the blank control at P<0.05, P<0.0l and P<0.001 levels (One-way ANOVA) |
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图 8 融合蛋白的半定量结果 Fig. 8 Semi-quantitative results of fusion protein 1~4分别表示质量浓度为100.0、50.0、25.0、12.5 μg/mL的标准蛋白样品；5~6为CHO-K1-RP1单克隆细胞株样品 1−4: Standard protein samples of 100.0, 50.0, 25.0 and 12.5 μg/mL；5−6: Samples of monoclonal cell line CHO-K1-RP1 |
采用ELISA试剂盒检测免疫后小鼠血清中特异性抗体水平。结果显示，一次免疫后，所有小鼠血清中的特异性抗体水平均较低；二次免疫后，除对照组外，其余各试验组小鼠血清中特异性抗体均出现不同程度的升高(P<0.05)；三次免疫后，除对照组外，其余各试验组小鼠血清中特异性抗体水平均较高(P<0.05)，其中FMD亚单位疫苗组与FMD商品化灭活疫苗组小鼠抗体水平无显著差异(P>0.05)(图9)。表明本研究制备的FMD亚单位疫苗能够有效刺激小鼠机体产生免疫应答反应。
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图 9 免疫后小鼠血清特异性抗体检测结果 Fig. 9 Results of the serum specific antibody titer identification in immunized mice 相同免疫次数柱子上方的不同小写字母表示不同组间具有显著差异(P<0.05，双因素方差分析) Different lowercase letters on the columns of the same immunization time represent significant differences among different groups (P<0.05, two-way ANOVA) |
FMD是一种极具传染性的偶蹄类动物病毒病，虽然大多数易感动物可以在感染后幸存下来，但病灶常造成动物群体的生产率低下，严重制约全球养殖业发展[21]。随着国际贸易的日益密切，FMD的防治日趋困难。英国于1892年率先制定了控制FMD的基本程序，包括杀死并销毁所有受感染和接触病原的易感动物，对受影响的场所进行彻底清洁和消毒等[22]。直到19世纪50年代，法国学者Frenkel[23]从在屠宰场收集的牛舌上皮中分离出FMDV并对其进行了体外培养，才使得大规模生产疫苗成为可能。目前，接种疫苗仍然是多数国家和地区防控该病的常见方法，灭活疫苗因免疫程序简单被广泛使用，但我们也要正确认识灭活疫苗存在的一些缺点。因此，研究者们需要开拓创新，研制出安全且高效的FMD新型疫苗，为在世界范围内控制甚至消灭FMD提供新的解决途径。
结构蛋白VP1不仅是病毒粒子识别受体细胞的关键蛋白，还包含多个重要的抗原表位，是研制FMD新型疫苗时的首选蛋白[24]。Cao等[25]研制出不同亚型的含有VP1 G-H环和Th表位的B4疫苗，并将其与Ploy(I︰C)联合免疫动物，结果发现该疫苗可使动物机体获得抵抗多个亚型毒株的交叉保护。高明等[26]设计并合成了FMDV VP1上的优势抗原表位基因串联表达盒，与猪IgG重链恒定区基因在大肠埃希菌中实现共表达，纯化后的蛋白与佐剂混合制成亚单位疫苗，免疫小鼠后能检测到高水平中和抗体。本研究根据近年来我国猪FMD的流行特点，以猪O型FMDV的结构蛋白VP1为基础，重复串联该片段上的优势抗原表位(第16~44、141~160和200~213位氨基酸)基因，以linker进行连接后，人工合成重组基因RP1，以期通过CHO-K1细胞表达获得高免疫原性抗原蛋白。
截至2012年，哺乳动物蛋白表达系统已经成为临床应用上的主要重组蛋白生产系统，生产了市场上将近一半份额的生物制药产品[27]。该系统首选的CHO细胞具有高效的翻译后修饰能力，其产生的糖基化蛋白与人体相容并具有显著的生物活性[28]。另外，CHO细胞具有在生物反应器中生长至高密度的能力，且对病毒的传播具有较低的风险[29]。由疏水性氨基酸构成的信号肽序列具有很强的外源蛋白分泌能力，在蛋白分泌表达中扮演着重要角色[30]。根据已有的报道[20]，我们在设计重组基因RP1序列时引入了高斯荧光素酶信号肽，以期获得高分泌型融合蛋白。但是，只有极少量的RP1蛋白能分泌到细胞上清液中，以至于需要对上清液进行多倍浓缩才能检测到微量的目的蛋白。我们推测信号肽要与目的蛋白相适应才有助于提高外源蛋白的分泌表达水平，因此在进行蛋白分泌表达研究时要综合考虑目的蛋白的理化特性，选择与之适应的信号肽来提高蛋白的分泌水平。本研究表达的融合蛋白RP1可作为FMD亚单位疫苗研制的候选蛋白，在后续的工作中，我们还需进一步优化表达条件以提高蛋白的表达水平和分泌水平。
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