2022, Vol. 43
2. 海南大学 热带作物学院, 海南 海口 570228
2. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou 570228, China
木薯Manihot esculenta Crantz是大戟科木薯属植物，世界三大薯类作物之一，原产自南美洲巴西等地，现在是我国热带以及亚热带地区重要的经济作物。木薯是无性繁殖作物，在生产中以种茎繁殖为主，种茎的好坏不仅影响全苗质量，而且影响植株的生长、块根分化，因此，种茎的贮藏质量直接影响木薯产业的发展[1-2]。近些年来，我国木薯的产地向北迁移，导致木薯种茎的贮藏期变长。木薯种茎在一般情况下需要贮藏2~3个月，有些地方甚至需要4~5个月才能种植[3]，在贮藏的过程中，如果环境温度过高或者贮藏时间过久，木薯种茎离体后极容易干旱失水，从而影响木薯种茎的成活率，最终影响到木薯的生长发育以及最终产量。所以，开展低温贮藏对木薯种茎生理特性影响的研究以及了解采后贮藏木薯种茎内相关可溶性糖的转化，有助于改良木薯种茎贮藏方式和提高木薯产量。
在植物的生命周期中，种子萌发和早期幼苗生长依赖于贮藏物质，主要是碳水化合物，它们以可溶性糖(蔗糖、葡萄糖和果糖)的形式从种子贮藏组织转移到茎和胚根等各种器官，是细胞生长和维持渗透稳态所必需物质[4-5]。蔗糖是可溶性糖的主要成分之一，在光合作用中产生再通过韧皮部运输到库组织进行利用和储存[6]；葡萄糖是植物体中的营养物质和信号分子，不仅参与糖酵解过程，而且可被己糖激酶感知[7-8]；果糖是由蔗糖通过与细胞壁结合的转化酶结合分解而成，具有一种特定的感知与信号通路，该通路共享下游信号成分，如脱落酸和葡萄糖信号中的成分[9]。可溶性糖对环境胁迫高度敏感，环境胁迫作用于从源器官到库器官的碳水化合物供应[10]。可溶性糖的关键作用是通过糖代谢产生更多的保护性物质，为正常的代谢过程提供能源，同时也可提高细胞的渗透势，增强保水性能，维持膨压并且能够有效地清除ROS，维持正常的生理代谢功能，避免原生质体在逆境条件下脱水受到伤害，从而对原生质膜起到保护作用[11-12]。植物在逆境时可以通过增加可溶性糖含量来提高对环境的适应性。单忠英等[13]发现，木薯苗在受到干旱胁迫后，叶片内的可溶性糖含量随着供水量的增加而逐渐下降，在干旱胁迫下木薯苗能积累更多的可溶性糖，增强渗透调节能力，提高抗旱能力。Shi等[14]发现，失水胁迫处理组狗牙根的可溶性糖含量显著高于对照组。
海藻糖是一种非还原性双糖，广泛存在于真菌、细菌及植物和无脊椎动物体内，但在大多数高等植物中，海藻糖仅以痕量存在，而且检测到的痕量是不可重复的，并且一度被怀疑是微生物污染[15]。海藻糖具有多种生物学功能，既可作为能量来源又作为非生物胁迫的保护性糖或信号糖[16-18]。海藻糖是木薯在干旱环境中产生的重要物质。赵超等[19]发现在干旱胁迫下，木薯种茎皮层和中柱均产生较高浓度的海藻糖，而对照并未产生海藻糖。张丹[20]通过定量PCR检测出干旱胁迫下木薯根部海藻糖合成酶基因TPS1-3表达量最高，推测其在木薯抗干旱调控中起重要作用。Han等[21]在耐旱作物木薯、麻疯树和蓖麻中发现了大量海藻糖。
海藻糖–6–磷酸合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase，TPS)基因是海藻糖合成酶的关键基因。研究发现，拟南芥TPS基因家族有11个基因，其中AtTPS基因家族可进一步划分为AtTPS1~4和AtTPS5~11这2个亚族。目前仅AtTPS1基因被证实可以明显影响TPS酶活性，且对植物生长代谢过程有影响，而TPS2~4基因被推测仅对十字花科植物的TPS蛋白酶有作用，此外，TPS5~TPS11基因的生物学功能仍不明确[22-23]。木薯TPS基因家族通过转录组数据鉴定有12个基因，与拟南芥TPS基因家族数据类似，同样分为MeTPS1~4和MeTPS5~12这2个亚族。推测MeTPS1~4为有活性的海藻糖合成酶基因，而MeTPS5~12都具有完整的TPS结构域以及TPS活性所需的基序，但是这8个基因可能是没有活性的[21]。
前期研究普遍比较重视木薯的根系和叶片，而对木薯种茎的关注较少，且大部分对种茎的研究是与生长期种茎有关，对于采后贮藏种茎的生理及信号途径的研究较少见。为此，我们通过将‘木薯60444’种茎置于不同温度贮藏0~30 d，了解木薯种茎在不同温度长时间贮藏后可溶性糖含量变化趋势，解析低温贮藏木薯种茎生理变化及其分子机制，同时也为木薯栽培提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料获取与处理试验地点为海南省海口市，地理坐标为N20.03°、E110.33°，地处热带地区，夏季处于3—10月，夏季室外最高温度为38 ℃左右，室温为22 ℃左右。试验材料为‘木薯60444’，由中国热带农业科学院热带生物技术研究所功能基因组研究实验室提供。选取长度、长势大致相同的茎段，平均分成2份，分别进行低温(20±2) ℃与常温(36±2) ℃贮藏处理，每个处理组分别在贮藏0、10、20、30 d后称质量，并取材分别用于RNA抽提和可溶性糖含量测定。
1.2 可溶性糖含量测定茎段于105 ℃烘箱中杀青20 min，并于80 ℃烘干至恒质量后送至江苏三黍生物科技有限公司做靶向代谢物检测。
1.3 RNA提取及cDNA合成称取木薯种茎样品2.0 g，用液氮研磨成粉末，按照RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书，提取木薯总RNA，使用超微量分光光度计NanoDrop 2000检测总RNA的浓度和纯度。参照FastKing Gdna Dispelling RT SuperMix反转录试剂盒(TaKaRa)的说明进行反转录，存放于–80 ℃冰箱。
1.4 实时荧光定量PCR分析利用NCBI网站设计定量引物(表1)，引物由北京擎科生物科技有限公司海口合成部合成。以木薯内参基因MeActin为参照使用实时荧光定量PCR技术分析基因的相对表达量。试剂盒为SYBR® Premix Ex Taq™ II(Tli RNaseH Plus)，购于TaKaRa公司。使用的仪器为Applied Biosystems StepOneTM and StepOnePlusTM Real-Time PCR Systems，采用2−ΔΔCt法计算相对表达量。
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表 1 引物序列 Table 1 Primer sequence |
各数据取3次重复的平均值，试验数据采用Excel软件(Microsoft 2016)进行处理分析，采用OriginPro 2021、Photoshop软件作图。
2 结果与分析 2.1 低温贮藏组与常温贮藏组木薯种茎的失水率木薯种茎在不同温度贮藏10 d，低温贮藏组失水率低于常温贮藏组而且两者差异显著(P<0.01)；种茎贮藏20 d后，两者失水率差距进一步加大，二者差异极显著(P<0.001)；种茎在不同温度贮藏30 d，两者失水率差异达到最大值，达极显著水平(P<0.001)。因此，木薯种茎在低温贮藏下有助于保持水分(图1)。
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图 1 低温贮藏组与常温贮藏组木薯种茎的失水率 Fig. 1 Water loss rate of cassava stem reposited under low temperature and normal temperature “**”和“***”分别表示相同时间低温储藏组与常温储藏组在P<0.01和P<0.001水平差异显著(t检验) “**” and “***” indicate significant differences between low temperature storage group and normal temperature storage group at the same time at P<0.01 and P<0.001 levels respectively (t test) |
在不同温度贮藏0~30 d，低温贮藏组与常温贮藏组离体种茎的海藻糖含量均得到了提升，贮藏第20天，2种温度贮藏组种茎的海藻糖含量均达到最大值，低温贮藏组比常温贮藏组低86.14%。随着贮藏时间的继续延长，2组海藻糖的含量均下降。在贮藏期间，低温贮藏组海藻糖含量均低于常温贮藏组(图2A)。
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图 2 木薯种茎低温贮藏和常温贮藏0~30 d可溶性糖含量变化 Fig. 2 Changes of soluble sugar contents in cassava stems stored under low and normal temperature for 0–30 d “*”“**”和“***”分别表示在相同储藏时间低温贮藏组与常温贮藏组在P<0.05、P<0.01和P<0.001水平差异显著(t检验) “*” “**” and “***” indicate significant differences between low and normal temperature storage at the same time at P<0.05, P<0.01 and P<0.001 levels respectively (t test) |
在不同温度贮藏0~30 d，木薯种茎蔗糖含量整体下降，其中常温贮藏组在0~10 d下降幅度最大，在20 d时达到最低点，基本为0。不同的是，在低温贮藏组中，木薯种茎在10~20 d下降幅度最大，20~30 d蔗糖含量略有上升。总而言之，木薯种茎蔗糖含量在常温贮藏30 d后基本为0，低温贮藏30 d后的蔗糖含量高于常温贮藏组(图2B)。
在不同温度贮藏0~30 d，木薯种茎葡萄糖含量整体减少，低温贮藏组种茎中葡萄糖含量在前期下降较快，中期最明显，后期放缓。常温贮藏组葡萄糖含量在前期下降较快，有趣的是在中期缓慢增长，后期与低温处理含量变化趋势相似，呈缓慢下降趋势。在贮藏30 d时，不同温度贮藏的葡萄糖含量都达到最低点，低温贮藏组下降幅度较大(图2C)。
从图2D可以看出，果糖含量整体减少。在低温贮藏组，木薯种茎果糖含量在0~10 d缓慢下降，在10~20 d快速下降，在30 d略有上升。常温储藏组果糖含量在0~10 d降幅最快，随后不断减慢，在30 d达到最低点。低温贮藏组与常温贮藏组在贮藏10 d时果糖含量相差最大。
低温贮藏组与常温贮藏组木薯种茎麦芽糖含量都极低，并且整体都呈下降趋势，均在贮藏20 d时降至最低点，在20~30 d略上升(图2E)。
2.2.2 可溶性糖各组分比例变化由图3可以看出，在低温与常温贮藏0 d时，木薯种茎各可溶性糖组分所占比例大致相同，其中蔗糖、葡萄糖和果糖为主要成分，海藻糖、麦芽糖比例极低。而在贮藏30 d后，常温贮藏组海藻糖与葡萄糖为主要成分，蔗糖、果糖和麦芽糖比例较低；低温贮藏组葡萄糖为主要成分，海藻糖、蔗糖、果糖和麦芽糖比例较低。
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图 3 木薯种茎低温与常温储藏0~30 d可溶性糖各组分比例 Fig. 3 Proportion of each soluble sugar component in cassava stem stored under low and normal temperature for 0–30 d |
贮藏10 d，常温贮藏组海藻糖、蔗糖、葡萄糖比例变化明显，低温贮藏组蔗糖和葡萄糖比例变化明显。常温贮藏组海藻糖比例相比常温贮藏0 d高37.24%，而低温贮藏组海藻糖比例仅比低温贮藏0 d高0.16%。低温与常温贮藏组葡萄糖含量都呈下降趋势，低温贮藏10 d比初始低5.36%，常温贮藏10 d比初始低7.34%。蔗糖常温贮藏10 d后比初始降低28.79%，而低温贮藏10 d比初始增长4.16%。果糖含量变化不明显，常温贮藏10 d比初始下降1.22%，低温贮藏10 d比初始增长1.44%。麦芽糖整体处于极低水平，未有明显变化，常温贮藏10 d后比初始增长0.10%，而低温贮藏10 d后比初始降低0.09%。
当木薯种茎贮藏10~20 d时，海藻糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖组分都发生了改变，其中在低温贮藏组海藻糖、蔗糖、葡萄糖和果糖比例变化较大，常温贮藏组中海藻糖、蔗糖、葡萄糖、果糖比例变化较大。常温贮藏20 d海藻糖占比77.35%，比常温贮藏10 d提高了38.78%；低温贮藏20 d海藻糖占比33.22%，比低温贮藏10 d提高32.72%。无论是常温贮藏还是低温贮藏20 d葡萄糖占比都比10 d下降，其中低温贮藏20 d葡萄糖含量占比33.97%，比贮藏10 d提高8.94%；常温贮藏20 d葡萄糖占比19.05%，相较常温贮藏10 d降低0.56%。木薯种茎离体贮藏20 d后，蔗糖占比也明显下降，低温贮藏20 d相较10 d下降10.45%。果糖占比明显下降，种茎常温贮藏20 d果糖占比贮藏较贮藏10 d下降20.90%，低温贮藏20 d相较贮藏10 d下降19.82%。木薯种茎贮藏20 d时麦芽糖含量极低，低温贮藏与常温贮藏麦芽糖比例均降至0。
当木薯种茎在不同温度贮藏30 d时，常温贮藏组海藻糖、葡萄糖含量未出现较大的变化，而低温贮藏组海藻糖、葡萄糖、蔗糖以及果糖等都出现了较大的变化。低温贮藏30 d后海藻糖含量相比贮藏20 d降低了13.98%，常温贮藏30 d后海藻糖含量相较贮藏20 d没有较大的变化，仅仅下降了0.44%。低温贮藏30 d后葡萄糖含量变化较大，比贮藏20 d提高了18.08%，而常温贮藏30 d的葡萄糖含量仅仅增加0.65%。低温贮藏组蔗糖含量变化较大，低温贮藏30 d后比贮藏20 d降低了9.38%，常温贮藏30 d蔗糖占比0.87%。低温贮藏30 d后果糖占比13.18%，比贮藏20 d占比高3.53%，常温贮藏30 d果糖占比2.51%，比贮藏20 d降低1.09%。低温贮藏30 d麦芽糖含量占比1.74%。
2.2.3 海藻糖含量与失水率的相关性分析本研究分别对低温贮藏组与常温贮藏组海藻糖含量与木薯种茎的失水率进行相关性分析，结果发现低温贮藏组与常温贮藏组海藻糖含量与木薯种茎的失水率均显著相关，低温贮藏组R1=0.636、常温贮藏组R2=0.835，R1<R2，这表明受到失水胁迫的程度越高，海藻糖浓度越高；并且，对低温贮藏组中海藻糖含量与木薯种茎失水率的线性回归方程与常温贮藏组中海藻糖含量与木薯种茎失水率的线性回归方程进行t检验，得t=0.014，两者差异显著(P<0.05)。分析表明，低温贮藏更容易保水，并且种茎中海藻糖含量更不易受失水影响(图4)。
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图 4 低温贮藏与常温贮藏木薯种茎海藻糖含量与失水率的相关性分析 Fig. 4 Correlation analyses between trehalose content and water loss rate of cassava stem stored under low and normal temperature |
6–磷酸果糖激酶(基因号：Manes.05G021200)，为糖酵解的限速酶。由图5A所示，木薯种茎在低温贮藏10 d时基因相对表达量迅速升高，在20 d时达到最高点，在30 d时下降到1左右；而常温贮藏0 d后迅速增长，在20 d左右达到最高点，在20 d后相对表达量下降，但仍然较贮藏10 d高。低温贮藏组6–磷酸果糖激酶基因相对表达量整体低于常温贮藏组，表明低温贮藏有效降低木薯种茎的糖酵解速率。
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图 5 木薯种茎低温贮藏和常温贮藏0~30 d可溶性糖代谢相关基因表达 Fig. 5 Expression of genes related to soluble sugar metabolism in cassava stems stored under low and normal temperature for 0−30 d “*”和“**”分别表示在相同储藏时间低温贮藏组与常温贮藏组在P<0.05和P<0.01水平差异显著(t检验) “*” and “**” indicate significant differences between low and normal temperature storage at the same time at P<0.05 and P<0.01 levels respectively (t test) |
葡糖磷酸变位酶(基因号：Manes.06G141300)，参与糖酵解糖异生，可以催化葡萄糖–1–磷酸盐和葡萄糖–6–磷酸盐相互转化，在糖代谢中起重要作用。如图5B所示，木薯种茎在低温贮藏组0~30 d其相对表达量呈现先增长后降低，20 d时达到最高点；而常温贮藏组基因相对表达量在0~20 d增长趋势与低温贮藏组近似，20 d后继续增长，30 d达到最高点，30 d时低温与常温贮藏组差异显著(P<0.01)。
碱性/中性转化酶(基因号：Manes.03G208400)，可以将蔗糖不可逆地水解为果糖和葡萄糖，是植物体内分解代谢的关键酶。碱性/中性转化酶基因由低温贮藏0 d开始增长在10 d达到最高点，随后呈下降趋势；常温贮藏组基因相对表达量在10 d时并未有明显变化，20 d时迅速提高，是同期低温贮藏的6倍，20~30 d开始下降至10附近，但仍然高于同期低温贮藏的相对表达量(图5C)。
麦芽糖化酶(基因号：Manes.08G060600)可将麦芽糖转化为葡萄糖。由图5D可知，低温贮藏组相对表达量整体呈先上升后下降的趋势，10 d时达到最大值，20 d时降至最低点，30 d时比20 d略有上升，相对表达量为1左右；常温贮藏组与低温贮藏组趋势大致相似，10 d时麦芽糖化酶相对表达量达到最大值，大致是低温贮藏组的2倍；低温贮藏组麦芽糖化酶在30 d时上调表达。
2.3.2 海藻糖–6–磷酸合成酶基因家族部分基因的相对表达海藻糖–6–磷酸合成酶是木薯海藻糖合成途径中的关键酶。通过实时荧光定量PCR研究发现木薯种茎在失水逆境中响应信号为MeTPS-1(基因号：Manes.05G087900)、MeTPS-2(基因号：Manes.01G198900)、MeTPS-3(基因号：Manes.16G042700)，种茎中其他海藻糖–6–磷酸合成酶基因(基因号：Manes.17G085400、Manes.14G067800、Manes.15G098800、Manes.06G103000)仅在0 d响应或者不响应(图6)。
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图 6 木薯种茎低温贮藏和常温贮藏0~30 d海藻糖–6–磷酸合成酶(TPS)基因家族部分基因相对表达量 Fig. 6 Relative expression levels of some genes in TPS gene family in cassava stems stored under low and normal temperature for 0−30 d “*”和“**”分别表示在相同储藏时间低温贮藏组与常温贮藏组在P<0.05和P<0.01水平差异显著(t检验) “*” and “**” indicate significant differences between low and normal temperature storage at the same time at P<0.05 and P<0.01 levels respectively (t test) |
图6A为木薯种茎中MeTPS-1在低温以及常温贮藏后的表达模式，低温以及常温贮藏10 d后均明显提高，并在20 d时达到最高点，整体变化趋势与图2A海藻糖含量变化趋势相似。其中低温贮藏组MeTPS-1相对表达量在10 d后上升较快，20 d时仅为同期常温贮藏组的50%(P<0.05)，20 d后迅速下降。常温贮藏组同期相对表达量均高于低温贮藏。
低温贮藏组MeTPS-2相对表达量在前20 d呈上升趋势，20 d时达到最大值，常温贮藏组在10 d时达最大值，在20 d时归于0(图6B)。
MeTPS-3仅在低温贮藏组中有表达，10 d时相对表达量高于0 d，随后则迅速下降，于20 d时归于0附近(图6C)。
由此可以看出，在木薯种茎离体贮藏试验中，海藻糖–6–磷酸合成酶主要由MeTPS-1响应，MeTPS-2、MeTPS-3均表现为在失水胁迫后上调表达，但是部分信号并未响应该试验。
3 讨论与结论海藻糖存在于多种生物体内，可以作为能源物质，也可以作为逆境胁迫下的信号和保护性物质[19, 24-25]。Han等[21]在木薯中发现海藻糖、果糖、葡萄糖和蔗糖等渗透物质的浓度与保水能力呈正相关，且海藻糖对木薯的渗透胁迫耐受性比果糖、葡萄糖和蔗糖更重要。Miranda等[26]在拟南芥中发现过量表达酵母TPS1和TPS2可以增加转基因品系对非生物胁迫的抗性，包括冷冻、干旱、盐和热胁迫。在木薯种茎中海藻糖含量与失水胁迫高度相关，表明海藻糖确实是响应木薯种茎失水胁迫的关键物质，低温贮藏组海藻糖含量与木薯种茎失水率相关系数弱于常温贮藏组，表明低温贮藏有效降低失水胁迫对木薯种茎的影响。赵超等[19]发现‘South China 124’和‘Argentina 7’干旱处理海藻糖含量分别在6 和12 d降低，但并未给出具体分析。Rosa等[10]研究表明糖感应途径调节代谢状态，高浓度糖表明良好的调节代谢状态，而低糖水平表明可能糖代谢失调。本试验中低温贮藏组与常温贮藏组种茎贮藏后期海藻糖含量呈下降趋势，推测在失水胁迫后期，由于木薯种茎中其他可溶性糖含量均处于较低水平，海藻糖转化为其他物质维持木薯种茎的正常代谢过程。
植物在逆境胁迫中，海藻糖–6–磷酸合成酶相关响应基因可能较为单一，在拟南芥和水稻中，AtTPS1和OsTPS1分别被证明是唯一有活性的TPS基因，而剩余的TPS蛋白缺乏TPS活性[27-28]。Han等[21]在烟草中证实MeTPS1(基因号：Manes.15G098800)有活性。本试验通过实时荧光定量PCR检测糖–6–磷酸合成酶相关基因表达，发现在木薯种茎中仅有3个基因响应不同贮藏温度下的失水胁迫，且只有MeTPS-1(基因号：Manes.05G087900)具有完整的信号表达，推测在TPS基因家族中，MeTPS-1为响应木薯种茎失水胁迫的主要基因。
木薯种茎在前期受到失水胁迫，种茎中的蔗糖在碱性/中性水解酶的作用下水解成分子量更小的葡萄糖与果糖，参与木薯种茎的糖酵解过程，提高木薯种茎的渗透调节能力；在蔗糖合酶的作用下水解成UDP–葡萄糖和1–磷酸葡萄糖参与海藻糖合成途径，提升木薯种茎在短时间内的抗旱能力，保护生物细胞以及生物活性物质在不良环境下免遭破坏。果糖与麦芽糖在相应酶的作用下转化为6–磷酸葡萄糖，而6–磷酸葡萄糖既可以参与糖酵解生成能量维持木薯种茎的代谢过程，又可以在海藻糖–6–磷酸合成酶的作用下参与海藻糖的形成。在常温贮藏组中葡萄糖含量中期出现上涨的趋势，可能是中期种茎脱水胁迫促使蔗糖大量水解成葡萄糖和果糖，而果糖和麦芽糖也转化为葡萄糖。在低温贮藏组后期蔗糖、果糖、麦芽糖含量呈上升趋势，推测由于低温贮藏组后期糖酵解速度较低，部分葡萄糖与海藻糖在后期转化为蔗糖、果糖、麦芽糖。
对木薯种茎海藻糖的研究发现，海藻糖含量上调表明本研究的低温贮藏温度可能并不是最佳温度，因此，在后续试验中可以通过设置温度梯度寻找木薯种茎最适合的贮藏温度，提高木薯种茎在长时间贮藏后的成活率。海藻糖–6–磷酸合成酶是优秀的抗逆基因，它合成的6–磷酸海藻糖作为木薯海藻糖合成途径的中间代谢物质，具有不可替代的作用。目前海藻糖–6–磷酸合成酶基因在木薯中的研究还相对较少，但在其他模式作物中研究较为成熟，Shim等[29]发现细菌海藻糖生物合成基因的异源表达响应高盐胁迫，增强马铃薯植物中海藻糖的积累而且没有影响马铃薯的生长，因此可以考虑将木薯6–磷酸海藻糖合成酶基因导入其他作物中，增强作物的抗逆性。
总而言之，本试验探究低温贮藏与常温贮藏对离体木薯种茎影响的研究表明，低温贮藏有助于减少种茎失水，降低糖酵解相关酶基因的表达，提高海藻糖含量，维持木薯种茎活力，延长贮藏时间，同时种茎海藻糖含量与种茎的失水胁迫呈强相关性，且低温贮藏组相关系数小于常温贮藏组，表明低温贮藏组种茎中海藻糖含量更不易受失水影响。因此低温贮藏方式有效，可以通过控制贮藏温度的方式大批量贮藏木薯种茎，提高木薯种茎的成活率，最终有效提高木薯产量。
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