2023, Vol. 44
金黄色葡萄球菌(以下简称“金葡菌”)Staphylococcus aureus是一种革兰阳性球菌，可引起肺和皮肤组织感染，甚至危及生命。作为一种机会致病菌，金葡菌已成为外科手术感染及医疗器械污染中最常见的病原体[1-3]。近年来，随着抗生素的大量使用，金葡菌耐药性逐渐增强，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的出现引起了全球的广泛关注。有研究表明，金葡菌可通过噬菌体、质粒、转座子及葡萄球菌盒式染色体(Staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec)等方式进行耐药基因的水平转移[4-6]。mecA作为MRSA菌株携带的耐药基因，已有研究表明mecA主要通过SCCmec元件进行水平转移[7-8]。
SCCmec是一种具有高度多样性的移动遗传因子。1999年首次测定了1982年分离的日本金葡菌N315菌株的mec整体结构及DNA序列。1年后，mecDNA被发现是由2个位点特异性重组酶基因ccrA和ccrB驱动的新基因元件，命名为SCCmec[9]。SCCmec (SCC家族的主要成员)是一种携带mec基因(mecA、mecB和mecC)以及控制其表达的基因mecR1(编码信号转导蛋白mecR1)和mecI(编码抑制蛋白mecI)的移动遗传元件，并作为葡萄球菌菌株间基因信息交换的载体。SCCmec位于葡萄球菌染色体复制起点附近，插入在插入位点attB (orfX的3'端)。SCCmec有3个基本的遗传因素：ccr基因复合体(由ccrAB或ccrC及其周围的ORFs组成)、mec基因复合体(由mec基因、插入序列和周围的ORFs组成)和连接区(J区)。在ccr基因复合体中，通过ccrAB或ccrC位点特异性重组，可以将多个耐药和耐重金属基因插入SCCmec中，SCCmec可通过ccrAB或ccrC的精确切除和整合，整合到葡萄球菌菌株的染色体上；因此，不同的葡萄球菌菌株交换遗传信息，以适应不同的环境和抗生素选择的压力[10]。SCCmec编码一种新的特异性青霉素结合蛋白(PBP2a)，与金葡菌内源性青霉素结合蛋白相比，PBP2a与β–内酰胺的结合亲和力降低，导致抗生素失活。与其他对β–内酰胺类抗生素的抑制机制不同，MRSA还能够通过PBP2a持续合成独特的细胞壁成分。由于获得了SCCmec元件，甲氧西林敏感金葡菌(Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus，MSSA)进化为MRSA[11]。根据各类型SCCmec在J区域的差异，将SCCmec分为不同的型和亚型。III型SCCmec在巴西、波兰、伊朗、土耳其、马来西亚、泰国、中国和中国台湾等国家或地区为主要检出类型[12]。本研究通过对实验室60株二代测序金葡菌基因组序列SCCmec元件进行比对分析，发现CRISPR阳性(CRISPR+)和CRISPR阴性(CRISPR−)不同菌株中都携带SCCmec元件，SCCmec元件的主要类型为III型，另外有1株为VIII型，1株为XII型，与报道结果一致。
成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)是存在于原核生物中的一种适应性免疫系统。有研究表明，约50%的细菌携带CRISPR/Cas系统[13]。它能够靶向切割核酸序列，从而抵御噬菌体、质粒等外源基因的入侵，保持细菌自身遗传结构的稳定[14]。CRISPR/Cas系统能否限制细菌耐药基因和毒力基因的水平转移，目前还没有明确的结论。Marraffini等[15]发现表皮葡萄球菌RP62a菌株的CRISPR/Cas系统可以阻止质粒的结合转移。张蒙蒙等[16]发现葡萄球菌中CRISPR/Cas系统可以限制mecA等耐药基因的转移。目前，金葡菌中CRISPR/Cas系统对细菌耐药基因和毒力基因的影响还不清楚。本研究以NCBI数据库575株金葡菌的基因组序列为研究对象，探讨CRISPR结构对其耐药基因和毒力基因的影响，并通过对实验室分离菌株二代测序基因组序列进行分析，做进一步验证。
1 材料与方法 1.1 材料575株金葡菌基因组序列下载自NCBI数据库(
通过CRISPRs finder (
对575株金葡菌通过Center for Genomic Epidemiology在线网站(
通过Center for Genomic Epidemiology网站下载整理耐药基因和毒力基因数据库，预测金葡菌基因组的ORF，利用blastn软件进行耐药基因和毒力基因的比对(序列一致率>80%，覆盖率>70%)。
1.2.4 原噬菌体和接合质粒的比对分析实验室60株金葡菌基因组通过PHASTER在线网站(
采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，CRISPR+和CRISPR−与耐药基因和毒力基因之间的关系采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果与分析 2.1 金葡菌基因组中CRISPR结构分布概况公共数据库575株金葡菌中有62株(11%)含有确证的CRISPR位点(CRISPR+)，513株(89%)无或仅含有可疑的CRISPR结构(CRISPR−)。实验室60株金葡菌中有14株(23%)含有确证的CRISPR位点(CRISPR+)，46株(77%)无或仅含有可疑的CRISPR结构(CRISPR−)。
2.2 金葡菌MLST型别及相关性分析对575株金葡菌基因组进行MLST分型，536株可以进行ST分型，共得到81个ST型别。对基因组进行系统发育树的构建，如图1A所示。我们将ST型别数量≥10的菌株标注不同的颜色，其他型别菌株以白色显示，同时将新ST型菌株以黑色标注。系统发育树显示，ST8型别的菌株所占的比例最高，为19%(111/575)；其次是ST5，占比达到13%(77/575)。在CRISPR+菌株中，最具有代表性的型别是ST398；CRISPR−菌株中，最具有代表性的型别是ST8。通过绘制韦恩图来分析CRISPR+与CRISPR−菌株的关系，如图1B所示，CRISPR+与CRISPR−之间有11个共同的ST型，菌株之间具有相关性。
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图 1 公共数据库基因组CRISPR+和CRISPR−金葡菌MLST型别系统发育树(A)和ST型别交叉情况(B) Fig. 1 Phylogenetic tree (A) and ST type crossover (B) of CRISPR+ and CRISPR−Staphylococcus aureus MLST types in public database genome |
公共数据库基因组中，62株CRISPR+金葡菌中阳性率最高的耐药基因是tet(38)，占比高达90%(56/62)；其次是blaZ，占比60%(37/62)。与CRISPR+菌株相比，513株CRISPR−菌株中ant(4')-Ib、aph(3')-Ⅲa、aad(6)和msr(A)的阳性率高(P<0.05)。CRISPR−菌株耐药基因的种类多于CRISPR+菌株(表1)。
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表 1 公共数据库基因组CRISPR+与CRISPR−菌株耐药基因比较1) Table 1 Comparison of drug resistance genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database genome |
实验室菌株基因组中，14株CRISPR+金葡菌中阳性率最高的耐药基因是blaZ，占比57%(8/14)。与CRISPR+菌株相比，46株CRISPR−菌株中ant(6)-Ia、cfr、mecA的阳性率高(P<0.05)。CRISPR+菌株的耐药基因种类少于CRISPR−菌株(表2)。
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表 2 实验室基因组CRISPR+与CRISPR−菌株耐药基因比较1) Table 2 Comparison of drug resistance genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the laboratory genome |
在菌株携带耐药基因的数量方面，CRISPR+菌株携带的耐药基因数量更少。公共数据库基因组CRISPR+菌株中，有58%(36/62) 的菌株携带耐药基因的数量≥10个，低于CRISPR−菌株(77%，395/513)；实验室菌株基因组CRISPR+菌株中，有29%(4/14) 的菌株携带耐药基因的数量≥10个，低于CRISPR−菌株(74%，34/46)(表3)。
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表 3 公共数据库与实验室基因组CRISPR+与CRISPR−菌株耐药基因数目比较 Table 3 Comparison of the number of drug resistance genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database and the laboratory genomes |
同时，我们分别对2组数据中CRISPR+和CRISPR−菌株携带耐药基因数目进行箱线图绘制。公共数据库基因组中，CRISPR+菌株整体携带耐药基因数量的平均值低于CRISPR−菌株，差异极显著(P<0.01)(图2A)。实验室基因组中，CRISPR+菌株整体携带耐药基因数量的平均值低于CRISPR−菌株，差异显著(P<0.05)(图2B)。
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图 2 公共数据库(A)和实验室(B)基因组 CRISPR+与CRISPR−菌株整体携带耐药基因数目平均值比较 Fig. 2 Comparison of the average number of drug resistance genes between all CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database (A) and the laboratory(B) genomes “*”和“**”分别表示在P<0.05 和 P<0.01 水平差异显著(χ2 检验) “*” and “**” indicates significant differences at P<0.05 and P<0.01 respectively (χ2 test) |
由表4可知，公共数据库基因组中，CRISPR+金葡菌阳性率最高的毒力基因是hlgB、hlgC，占比高达100%(62/62)；其次是aur，占比98%(61/62)。与CRISPR+菌株相比，CRISPR−菌株中splA、splB的阳性率高(P<0.05)。CRISPR−菌株毒力基因的种类多于CRISPR+菌株。
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表 4 公共数据库基因组CRISPR+与CRISPR−菌株毒力基因比较1) Table 4 Comparison of virulence genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database genome |
实验室菌株基因组中，CRISPR+金葡菌阳性率最高的毒力基因是aur、hlgA、hlgB和hlgC，占比71%(10/14)。与CRISPR+菌株相比，CRISPR−菌株中sei、sem、sen、seo和seu的阳性率高。CRISPR+菌株的毒力基因种类少于CRISPR−菌株(表5)。
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表 5 实验室基因组CRISPR+与CRISPR−菌株毒力基因比较 Table 5 Comparison of virulence genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the laboratory genome |
在菌株携带毒力基因的数量方面，CRISPR+菌株携带的毒力基因更少。公共数据库基因组CRISPR+菌株中，有35%(22/62) 的菌株携带毒力基因的数量≥10个，低于CRISPR−菌株(73%，374/513)；实验室菌株基因组CRISPR+菌株中，有7%(1/14)的菌株携带毒力基因的数量≥10个，低于CRISPR−菌株(41%，19/46)(表6)。
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表 6 公共数据库基因组CRISPR+与CRISPR−菌株毒力基因数目比较 Table 6 Comparison of the number of virulence genes between CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database genome |
同时，我们分别对2组数据中CRISPR+和CRISPR−菌株携带毒力基因数目进行箱线图绘制。公共数据库基因组中，CRISPR+菌株整体携带毒力基因数目的平均值低于CRISPR−菌株，差异极显著(P<0.01)(图3A)。实验室基因组中，CRISPR+菌株整体携带毒力基因数目的平均值低于CRISPR−菌株，差异显著(P<0.05)(图3B)。
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图 3 公共数据库(A)和实验室(B)基因组 CRISPR+和CRISPR−菌株整体携带毒力基因数目平均值比较 Fig. 3 Comparison of the average number of virulence genes between all CRISPR+ and CRISPR− strains for the public database genome (A) and the laboratory genome (B) “*”和“**”分别表示在 P<0.05 和 P<0.01 水平差异显著(χ2 检验) “*” and “**” indicates significant differences at P<0.05 and P<0.01 respectively (χ2 test) |
实验室60株金葡菌基因组原噬菌体比对结果显示，CRISPR+金葡菌中原噬菌体的携带率为29%(4/14)，CRISPR−金葡菌中原噬菌体的携带率为67%(31/46)。CRISPR−菌株携带更多的原噬菌体序列，与CRISPR+菌株之间差异显著(P<0.05)。接合质粒的分析结果显示，CRISPR+金葡菌中接合质粒的携带率为86%(12/14)，CRISPR−金葡菌中接合质粒的携带率为80%(37/46)。CRISPR−和CRISPR+菌株基本一致，无显著差异(P>0.05)。
3 讨论与结论 3.1 讨论CRISPR/Cas系统作为原核生物的一种适应性免疫系统，能抵御外来基因元件如噬菌体、质粒的入侵，保持细菌自身遗传结构的稳定。日本学者于1987年首次在大肠埃希菌中发现该结构[17]，Barrangou等[13]首次用试验证明CRISPR/Cas系统具有抵御外来噬菌体干扰的功能。本研究结果显示，CRISPR+金葡菌菌株大多含有较少的耐药基因和毒力基因，CRISPR结构能够限制耐药基因、毒力基因的水平转移，使细菌的遗传结构保持稳定[18]。
但是，从进化的角度看，基因的水平转移可以使细菌获取新的遗传物质，有利于细菌在复杂的环境中生存[19-20]。本研究在对毒力基因进行分析的过程中发现，极少数CRISPR+金葡菌携带的毒力基因数目高于CRISPR−菌株，这与Palmer等[21]的研究一致，说明在外源基因获取压力下，CRISPR/Cas系统往往处于失活状态。
细菌耐药性的产生主要依赖于耐药基因的水平转移，CRISPR/Cas系统是否能够限制耐药、毒力基因的水平转移，不同研究有不同的报道。有研究表明，一些种类的细菌几乎不携带CRISPR/Cas系统[22]；同时，也有相关研究表明，宿主菌可以通过丢失CRISPR结构来获得高度有益的外源DNA[23]。Touchon等[24]分析了263株大肠埃希菌的CRISPR/Cas系统，对CRISPR结构与耐药性的关系进行了分析，结果表明，CRISPR结构的存在并不能阻止耐药基因和质粒的水平转移。洪丽娟等[25]发现志贺菌中CRISPR结构对菌株耐药基因和耐药表型均无影响。然而，张蒙蒙等[16]发现葡萄球菌基因组中CRISPR/Cas系统携带率低，且基因座、Cas基因的结构和功能均不完善，仅较少的菌株中含有完整的CRISPR/Cas系统，完整的葡萄球菌CRISPR/Cas系统可能限制mecA基因的水平转移。Palmer等[21]发现CRISPR/Cas系统的存在限制了粪肠球菌中来自可移动元件的耐药基因间的水平传播。Marraffini等[15]通过试验证明葡萄球菌RP62a的CRISPR/Cas系统能够抵御噬菌体的入侵。同时，Watson等[26]研究表明CRISPR/Cas系统可以通过转导增强基因的水平转移。对于CRISPR结构与毒力基因的关系，Wiedenheft等[27]研究表明铜绿假单胞菌CRISPR/Cas系统的存在与小鼠中某些毒力基因的表达密切相关。
3.2 结论本研究通过对公共数据库金葡菌基因组中CRISPR/Cas系统、耐药基因和毒力基因进行比对分析，并利用实验室金葡菌基因组进行验证，发现金葡菌中CRISPR结构的存在可能影响金葡菌耐药、毒力基因的水平转移。CRISPR−菌株携带更多的原噬菌体序列，表明CRISPR−菌株更容易受到噬菌体和可移动质粒的干扰。本研究结果对进一步研究金葡菌耐药基因和毒力基因的传播有参考意义。
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