鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)是黄病毒科黄病毒属恩塔亚病毒群的一种新型黄病毒，可引起雏鸭腹泻和神经症状，蛋鸭卵巢出血坏死、产蛋量急剧下降，严重者出现死亡^[1]。近年来有研究报道，该病的感染宿主已扩大至麻雀、鹅、鸽子等多种禽类^[2]。该病毒的开放性阅读框(Open reading frame，ORF)编码产生1个3 425个氨基酸长度的多肽，在宿主和病毒蛋白酶的作用下，可水解为C、prM、E结构蛋白和NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5非结构蛋白^[3]。

E蛋白是DTMUV的外膜蛋白，包含大约501个氨基酸残基，由1 503个核苷酸残基构成，相对分子质量为54 200^[4]。其参与病毒的细胞膜融合和穿入，能刺激机体产生保护性的中和抗体，是主要的免疫原性蛋白^[5]。E蛋白空间结构多数为β−折叠，并形成3个不同的空间结构域——Domain I、Domain II和Domain III，分别简称DI、DII和DIII^[6]。其中，DI位于包膜蛋白的中部，通过柔性铰链连接DII^[7]，DI中的糖基化位点与病毒产生、pH敏感性和神经侵袭性有关^[8]。DII由2个从DI循环中投射出来的片段组成，折叠成指状结构，含有高度保守的疏水性顶端的融合环，称为融合肽(Fusion peptide，FP)。当融合形成构象时，融合肽负责与靶膜的直接相互作用^[9]。具有免疫球蛋白IgG样结构的E蛋白DIII位于融合E蛋白羧基端，只有1个二硫键影响E蛋白抗原结构正确性，该区包含众多抗原表位，在病毒结合细胞受体并入侵细胞机制中具有重要作用，是临床诊断和亚单位疫苗制备的重要靶候选区域^[10]。近年来研究表明，E蛋白是病毒的主要毒力抗原，它参与病毒的许多复制过程；此外，其所含的大量抗原表位与病毒入侵宿主细胞以及病毒致病性密切相关^[11]。而目前对DTMUV E蛋白DI、DII和DIII功能的研究较少。本研究旨在探讨E基因DI、DII和DIII真核表达产物对鸭胚成纤维细胞(Duck embryo fibroblast，DEF)细胞周期与细胞凋亡的影响，为E蛋白DI、DII和DIII的功能研究奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

pEGFP-N1真核表达质粒由长江大学动物科学学院禽病实验室保存；DMEM培养基、Lipo2000脂质体转染试剂、Opti-MEM培养基均购于Thermo Fisher Scientific公司；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒和细胞周期检测试剂盒购于Biosharp公司。

1.2 重组质粒的构建

根据DTMUV E蛋白基因及其结构域I、II和III基因核苷酸序列，设计pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII、pEGFP-N1-DIII 4种真核表达质粒，并交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，基因片段及长度见图1和表1。

1.3 质粒转染

参照Lipo2000脂质体转染试剂说明将pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII、pEGFP-N1-DIII和空载体pEGFP-N1转染DEF细胞。设置不转染质粒的细胞为阴性对照(CK)。

1.4 倒置荧光显微镜下观察GFP荧光表达

将质粒转染DEF 24 h后，将细胞置于倒置荧光显微镜下，观察GFP在细胞中的表达并拍照。

1.5 细胞总蛋白的提取

在质粒转染DEF 24 h后，弃去培养基，用胰酶消化，用DMEM完全培养基(含体积分数为10%的FBS)吹打细胞，收集于15 mL EP管中，1 500 r/min 离心5 min，用预冷PBS洗涤细胞，重复2次，去上清液。6孔板每孔加200 μL裂解液；裂解液用之前1 min加PMSF(蛋白酶抑制剂)，混匀，冰浴30 min。将细胞收集至1.5 mL离心管中，4 ℃条件下于14 000 r/min离心l0 min。小心吸取上清液，转移至新的15 mL离心管中，−80 ℃保存。

1.6 Western blot检测DTMUV E蛋白及其DI、DII和DIII

将蛋白样品加5× SDS凝胶上样缓冲液煮沸处理5 min后，进行SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。纯化蛋白经100 g/L SDS-PAGE分离后，采用湿法将蛋白质转印至硝酸纤维膜上，采用75 V电压作用1.5 h。将蛋白条放入封闭液(脱脂乳体积分数为5%的TBST溶液)中，在37 ℃条件下作用1.5 h。将蛋白条转移到一抗稀释液中，4 ℃慢摇，过夜。次日用TBST清洗3次后转移至二抗稀释液中，37 ℃慢摇，孵育1 h。用TBST清洗3次后按照Super ECL PLus超敏发光液显色试剂盒说明书显色。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡

在质粒转染细胞24、36 h后，用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，1 500 r/min离心5 min，去上清液。用预冷的PBS重悬细胞，1500 r/min离心5 min，去上清液，在用PBS重悬1次细胞、小心吸除上清液后，加入250 μL Binding buffer重悬细胞，吸取100 μL的细胞悬液于5 mL流式管中，加5 μL Annexin V-FITC，避光孵育10 min，上机前5 min加入10 μL碘化丙啶(PI)溶液，轻轻混匀。上机前在反应管中补加400 μL PBS重悬细胞，避光保存，随即进行流式细胞仪检测。

1.8 流式细胞术检测细胞周期

在质粒转染24、36 h后，小心吸除细胞培养液，用胰酶消化细胞，加入1 mL完全培养基收集细胞，1 500 r/min离心5 min，去上清液。用1 mL预冷PBS重悬细胞，去上清液。用1 mL预冷的70%(φ)乙醇溶液固定细胞，过夜。然后1500 r/min离心5 min，去上清液。加入预冷的PBS重悬细胞，1500 r/min离心5 min，去上清液。配制碘化丙啶染色液：对于1个样品，在0.5 mL染色缓冲液中加入25 μL碘化丙啶染色液(20 ×)和10 μL RNaseA (50 ×)，混匀待用。染色：每管细胞样品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，轻轻混匀重悬细胞沉淀，37 ℃避光孵育30 min，就可以进行流式检测，流式检测最好在5 h内完成。流式检测和分析：用流式细胞仪在微发波长488 nm处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用Flow Jo分析软件进行细胞DNA含量和光散射分析。

2 结果与分析 2.1 质粒转染DEF后GFP表达

利用倒置荧光显微镜对各组转染细胞进行观察，见图2。结果显示，在转染24 h后，可见pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII和pEGFP-N1-DIII重组质粒及pEGFP-N1空载体转染的DEF细胞出现明显的绿色荧光，GFP在DEF中有明显的表达。随着时间的推移，各组细胞荧光强度均有所增强。

2.2 E蛋白及其DI、DII和DIII在DEF中的表达

如图3所示，纯化后E蛋白及DI、DII和DIII均有单一条带，与目的片段大小相符，相对分子质量约为82 000、44 000、47 000、40 000，pEGFP-N1空载体与目的片段大小相符，相对分子质量约为27 000，证明重组质粒E蛋白及其DI、DII和DIII蛋白具有良好的表达。

2.3 质粒表达的蛋白对细胞凋亡的影响

pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII和pEGFP-N1-DIII重组质粒及pEGFP-N1空载体分别转染DEF 24、36 h后，收集各组细胞，用流式细胞仪检测。早期凋亡以Annexin V-FITC (A-FITC)染色为主，在流式细胞分析图(图4、5)中为右下区(Q3、Q7)细胞簇。晚期凋亡为Annexin V-FITC/PI (A-FITC/PI)双染色，在流式细胞分析图(图4、5)中为右上区(Q2、Q6)细胞簇。

检测结果表明，在质粒转染24 h后，与pEGFP-N1空载体转染组14.8%的早期凋亡率相比，pEGFP-N1-DII转染组细胞凋亡率略低，为14.0%；pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI和pEGFP-N1-DIII真核表达产物诱导DEF的早期凋亡率分别是16.4%、15.1%和17.2%，略高于空载体转染组。不同蛋白引起DEF晚期凋亡率的数据正好相反，相对于pEGFP-N1空载体转染组47.2%的晚期凋亡率，pEGFP-N1-DII转染组凋亡率略高，为49.4%，pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI和pEGFP-N1-DIII真核表达产物诱导DEF的细胞凋亡率分别是45.6%、42.9%和40.6%，略低于空载体转染组。质粒转染36 h后，pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII和pEGFP-N1-DIII真核表达产物诱导DEF的早期凋亡率分别是23.4%、18.5%、26.7%和29.4%，均明显高于pEGFP-N1空载体转染组15.2%的凋亡率。

通过分析各组细胞凋亡数据，结合细胞本身的凋亡背景，可以看出，pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII和pEGFP-N1-DIII重组质粒在转染DEF 24 h后，各组细胞早期凋亡率差异不明显；质粒转染细胞36 h后，相对于空载体组，pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII和pEGFP-N1-DIII重组质粒均能明显诱导细胞早期凋亡，但是各组诱导细胞凋亡能力存在一定差异。

2.4 质粒表达蛋白对细胞周期的影响

pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII和pEGFP-N1-DIII重组质粒及pEGFP-N1空载体分别转染DEF 24、36 h后，收集各组细胞，用流式细胞仪检测各质粒表达的蛋白对细胞周期的影响。质粒转染24 h后，pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII和pEGFP-N1-DIII试验组的DNA合成期(S期)细胞比例分别为5.43%、22.58%、12.75%和12.80%，都明显高于pEGFP-N1空载体转染组的4.38%；DNA合成后期与细胞分裂期(G2/M期)除了pEGFP-N1-E低于pEGFP-N1空载体转染组的14.08%外，pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII和pEGFP-N1-DIII组都高于pEGFP-N1空载体转染组，分别为17.64%、14.35%和14.95%。质粒转染36 h后，pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII和pEGFP-N1-DIII S期细胞比例相较于pEGFP-N1空载体转染组的9.69%明显上升；G2/M期pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DIII明显高于pEGFP-N1空载体转染组，而相较于24 h的pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII和pEGFP-N1-DIII G2/M期，细胞比例明显下降，分别下降了1.64%、11.42%、7.26%和4.67%。具体见表2、图6和图7。

3 讨论与结论

DTMUV E蛋白是诱导机体产生免疫保护性抗体的主要抗原，含有3个抗原表位区，分为DI、DII和DIII，DI主要包含3个区段——第1—51个aa、第137—196个aa、第293—311个aa，是糖基化位点和生物活性富集区；DII包含2个区段——第52—136个aa、第197—292个aa，为血凝活性及中和活性的富集区；DIII只含1个区段——第312—411个aa，主要参与受体结合过程^[12]。为探讨DTMUV E基因DI、DII和DIII真核表达产物对DEF细胞周期与细胞凋亡的影响，本研究设计、合成了E蛋白及其3个结构域的真核表达质粒，并转染到DEF，用流式细胞仪检测了细胞凋亡与细胞周期。

近年来，有许多学者对DTMUV诱导的细胞凋亡进行了广泛的研究。李秀丽等^[13]研究表明DTMUV能够显著引起细胞凋亡，导致脾脏淋巴细胞减少，严重影响脾脏的免疫功能。提金凤等^[14]研究发现感染坦布苏病毒(Tambursu virus，TMUV) 24 h昆明鼠的脾细胞中，细胞凋亡比例为27.9%，对照组为16.1%，感染TMUV 48 h昆明鼠的脾细胞中，细胞凋亡比例为32.22%，对照组为25.26%，试验组和对照组相比差异显著；证明TMUV可诱导昆明鼠发生显著的脾细胞凋亡，感染病毒时间越长，脾细胞凋亡越明显。Pan等^[15]研究发现DTMUV感染后DEF中细胞凋亡比例与这些细胞获得的病毒滴度呈正相关，DTMUV可能通过诱导细胞凋亡来促进病毒体的复制和传播。在本研究中，DTMUV E蛋白及其DI、DII和DIII重组质粒均能诱导细胞早期凋亡，且凋亡比例随时间延长逐渐增加，36 h的凋亡率(18.5%~29.4%)明显高于24 h的(14.0%~17.2%)，这与前人研究结果一致。但不同的结构域在病毒复制的过程中如何诱导细胞凋亡，凋亡过程与病毒的复制、毒力之间的关系值得进一步探讨。

于观留^[16]研究发现TMUV感染12、24 h后，BCL2A1 (B淋巴细胞瘤2A1抗凋亡蛋白)干扰组(siRNA-BCL2A1)的S期细胞比例与其对照组(siRNA-NC)相比显著增加(P<0.01)，即siRNA-BCL2A1可以诱导病毒感染后DEF在S期停滞，证明BCL2A1在调节病毒感染后的DEF细胞周期中发挥着重要作用。林昀^[17]发现在感染后12、24 h，TMUV感染组中处于S期和G2/M期的细胞比例显著升高，说明TMUV的感染可以诱导DEF在S期和G2/M期停滞。在本研究中，质粒转染24、36 h后，DTMUV E全长及其DI、DII和DIII均可以诱导S期的停滞，这与前人研究结果基本一致。DTMUV E蛋白全长及其DI、DII和DIII通过什么途径造成DEF凋亡，尚需进一步研究。

E蛋白是DTMUV的主要结构蛋白，在膜融合和介导病毒与细胞受体结合过程中起至关重要的作用，可直接影响病毒的宿主范围、组织嗜性和毒力^[18]。在本研究中，E蛋白及其3个结构域DI、DII和DIII不仅均可以诱导DEF早期凋亡，也可以引起DEF在S期的停滞，这可能为研究DTMUV E蛋白的功能以及致病机制提供了新的切入点。