防风Saposhnikovia divaricata为伞形科防风属多年生草本植物，以未抽花茎植株的干燥根入药，味辛、微甘、性温，具有止痉、祛风解表、胜湿止痛的功效^[1]。防风是新型冠状病毒诊疗方案推荐中成药“防风通圣丸”等中成药的重要原料，同时也是我国传统的出口药材，具有广阔的应用前景和可观的经济价值。近年来，随着防风栽培面积的扩大，防风枯萎病的发病范围逐步增加、发病程度逐步上升，造成防风大面积减产。尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum是引起防风枯萎病的主要病原菌，通过侵染防风根部导致防风叶片枯萎脱落、根部腐烂，已成为严重危害防风根茎类的病害之一^[2]。尖孢镰刀菌是一种具有很强致病能力的土传病原菌，寄主分布范围广，可导致上百种植物感染根部病害^[3]，如三七根腐病^[4]、辽五味根腐病^[5]、白术根腐病^[6]、黄精根腐病^[7]等。尖孢镰刀菌具有复杂的遗传多样性，依据不同寄主植物分化为不同专化型，目前已报道的专化型达120多种^[8]。而防治枯萎病的主要方法为及时拔出病株并撒施石灰粉消毒，以及施加化学药剂。然而长期使用农药不仅容易导致农药残留^[9]，还会导致病原菌产生抗药性^[10]、破坏生态平衡^[11]、造成环境污染并且对人类身体健康构成威胁^[12]。为减少因化学药剂的大量使用带来的农药残留及抗药性问题，农业农村部启动“双减”计划，积极推进新型绿色农药研发^[13]，而生物防治具有绿色安全、无污染等特点^[14]，为此，生防菌的开发与应用成为防治植物病害的热点^[15]。

药用植物根际微生物作为宝贵的微生物资源，其在植物病害生物防治方面的应用越来越引起研究者们的关注。近年来，利用根际微生物防治中药材土传病害研究取得一些进展，Daroodi等^[16]通过室内盆栽试验研究 Acrophialophora jodhpurensis对番茄根腐病的防治效果，结果表明A. jodhpurensisle可将番茄根腐病病情指数降低40%以上，并诱导番茄体内GPX、CAT、SOD、APX、酚类、木质素及铁离子等物质的积累。高芬等^[17]从黄芪根围土中分离出细菌菌株138株，经多重筛选后获得1株对黄芪根腐病拮抗效果较强的萎缩芽孢杆菌。目前，从防风分离得到的内生菌主要有防风壳针孢、独活白粉菌和旱芹叶点霉等^[18-20]，而关于防风根际土壤病原菌的分离和鉴定鲜有报道，因此从防风根际土壤中分离筛选对防风枯萎病具有较高防治效果的生防菌株，并用于防治防风枯萎病具有重要的理论和实际指导意义。本研究以防风根际土为材料，分离得到1株对防风枯萎病病原菌有良好拮抗效果的生防菌株，并对该菌株的形态、显微特征和18S rDNA基因序列进行鉴定，通过盆栽防效试验评价该生防真菌的生防效果，本研究对防风枯萎病防治、降低防风真菌病害、提高防风产量具有指导意义，同时可为微生物农药的开发利用提供依据。

1 材料与方法 1.1 供试材料

采用五点取样法，于2020年7月从吉林农业大学药用植物园(43°48′23″N，125°24′57″E)采集健康的1年生防风植物的根际土壤，装于无菌自封袋中，阴干后过20目筛备用。

尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、木贼镰刀菌F. equiseti、腐皮镰刀菌F. solani、恶疫霉Phytophthora cactorum、灰葡萄孢Botrytis cinerea、核盘菌Sclerotinia sclerotiorum、细极链格孢Alternaria tenuissima、鹅掌楸链格孢A. liriodendra和毁灭柱孢菌Cylindrocarpon destructans均由吉林农业大学中药材学院植物生理生态实验室提供。

多菌灵(沈阳经济开发区亚美花肥土厂)、枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(山东鲁抗生物农药有限责任公司)、哈茨木霉可湿性粉剂(山东绿陇生物科技有限公司)、有效成分质量分数97%的利福平(Rifampicin) (上海麦克林生化科技有限公司)、DNA提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0(TaKaRa宝日医生物技术有限公司)。

Nikon eclipse 50i 三目显微镜(尼康仪器有限公司)、THZ-702B全温度振荡培养箱(太仓市华美生化仪器厂)、PTC-300光照培养箱(上海三腾仪器有限公司)、DYY-8C电泳仪(北京六一生物科技有限公司)、Applied Biosystems ProFlex PCR仪(赛默飞世尔科技有限公司)、Multifug1 X1R高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司)。

1.2 拮抗真菌的分离纯化

称取防风根际土10 g，放入90 mL无菌生理盐水中，充分震荡，静置后吸取上清液1 mL，以10倍为梯度进行稀释，依次获得10⁻¹、10⁻²、10⁻³、10⁻⁴梯度稀释液，将各稀释液在PDA培养基中进行分离涂布，置于25 ℃恒温培养3 d后，挑取颜色、形态各异的单菌落进行纯化培养，置于4 ℃条件下保藏。

1.3 拮抗真菌的筛选

采用平板对峙法，利用打孔器将病原菌与待测菌株打取8 mm菌饼，以尖孢镰刀菌为靶标菌，接种于直径为90 mm的PDA培养皿中央，将分离得到的菌株接种于距培养皿中心25 mm处，以单接病原菌为对照，3次重复，25 ℃恒温培养7 d，计算抑菌率。

$ 抑菌率 =(D_{\text {对照 }}-D _{处理} ) / D_{\text {对照 }} \times 100 {\text{%}}, $

式中，D_对照、D_处理分别表示对照和处理菌株的直径，mm。

1.4 拮抗真菌的鉴定

将待测菌株打取8 mm菌饼，接种于PDA培养基中央，于25 ℃条件下恒温培养7 d，观察菌落颜色、形态、大小、分生孢子着生状态及大小，并参照《真菌鉴定手册》^[21]及《中国真菌志》^[22]对生防菌进行形态鉴定。

生防菌的分子鉴定：用试剂盒提取待测菌株基因组DNA，采用真菌通用引物ITS1 (5′-TCC GTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对待测菌株进行PCR扩增。反应体系Master mix 12.5 μL、ITS1 1 μL、ITS4 1 μL 、rDNA 2 μL、ddH₂O 8.5 μL，扩增程序为 94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 5 min^[23]。PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。扩增的PCR产物交由上海生工进行测序，测序结果在NCBI中进行BLAST比对，使用MEGA X软件Neighbor-joining法构建系统发育树。

1.5 拮抗真菌对尖孢镰刀菌菌丝生长的影响

将待测菌株与尖孢镰刀菌进行对峙培养，挑取对峙培养抑菌带处病原菌菌丝，制成临时玻片，于显微镜下观察病原菌菌丝状态，观察记录并拍照。

1.6 拮抗真菌的抑菌谱

用平板对峙法对拮抗菌株进行抑菌谱测定，测定待测菌株对木贼镰刀菌、腐皮镰刀菌、恶疫霉、灰葡萄孢、核盘菌、细极链格孢、鹅掌楸链格孢、毁灭柱孢菌等8种常见病原菌的抑制效果，并计算抑菌率。

1.7 拮抗真菌在土壤中的定殖

利用抗生素标记法，对待测菌株进行标记^[24]。将待测菌株相继在含有不同质量浓度利福平的PDB中进行逐级诱导，使菌株可在利福平质量浓度达300 μg/mL的PDB中稳定生长。收集标记菌株MR_Rif-97孢子悬液30 mL，浓度为1×10⁸ CFU/mL，在盆钵中均匀拌土，每盆300 g土壤，3次重复，以未接种标记菌株的土壤为空白对照。拌土结束后，每隔7 d进行1次标记菌株的分离。

标记菌株的分离：采用梯度稀释法，方法同“1.2”，取10⁻⁴稀释液，涂布于含有300 μg/mL利福平的PDA培养皿中，于25 ℃条件下培养3 d，统计培养皿中菌落数量，计算土壤中标记菌株的含菌量(CFU/g)。

1.8 拮抗菌株的盆栽防效及促生效果

选取生长状况一致的1年生健康防风苗进行盆栽试验。采用伤根灌溉法将防风根部及茎基部划伤，每株防风接种1×10⁷ CFU/mL尖孢镰刀菌孢子悬液10 mL。将防风设置为5种处理：多菌灵500倍液50 mL、1×10⁷ CFU/mL枯草芽孢杆菌可湿性粉剂50 mL、1×10⁷ CFU/mL哈茨木霉可湿性粉剂50 mL、1×10⁷ CFU/mL待测菌株孢子悬液10 mL以及等量清水对照(CK)，每种处理8株防风。

接种30 d后，取出防风并将根部清洗干净，统计防风叶片发病情况，并计算防风病情指数及防效。对防风株高、根长、株鲜质量、根鲜质量、株干质量、根干质量等生物量进行测定，评价待测菌株对防风的促生效果。

防风枯萎病病情分级标准^[25]：0级：植株健康，无枯萎症状；1级：叶片表面有黄色病斑，≤10%叶片发黄；3级：发病区域颜色加深，(10%，25%]叶片萎蔫发黄，开始下垂；5级：(25%，50%]叶片枯萎发黄，出现坏死斑块，叶片开始脱落；7级：植株生长受到明显抑制，茎秆瘦弱稀疏，(50%，75%]叶片黄褐色，叶片大量脱落；9级：全株萎蔫严重，叶片褐色，整体脱落，严重的植株整株枯萎死亡。

$ \begin{split} 病情指数 =&\displaystyle\sum (各级病株数 \times 各级代表值 ) /\\ &( 调查总株数 \times 最高级代表值 ) \times 100 {\text{%}}，\end{split} $

$ \begin{split} 防治效果 =& ( 对照病情指数 - 处理病情指数 ) / \\ &对照病情指数 \times 100 {\text{%}} 。\end{split} $

2 结果与分析 2.1 拮抗真菌的分离筛选

通过稀释涂布法共分离得到104株根际真菌，将分离得到的根际真菌与尖孢镰刀菌对峙培养后，具有抑菌效果的真菌菌株为5株，分别为MR-39、MR-73、MR-84、MR-96和MR-97，抑菌率分别为58.89%、60.00%、57.78%、57.41%和64.44%，其中菌株MR-97抑菌效果最好。

2.2 拮抗真菌的鉴定 2.2.1 形态学鉴定

菌落接种于PDA培养基在25 ℃条件下培养7 d，菌落直径为37~41 mm，初期菌落为白色，绒状，7 d后菌落生长为黄白色，背面为中等橙黄色，出现放射状皱纹，有橙红色液滴生产，并形成可溶性黄色分泌物，菌落边缘全缘。分生孢子头为球形，直径为9~20 μm，小梗双层，排列紧密呈放射状，梗基尺寸为5.5~8.5 μm×1.5~2.5 μm，瓶梗尺寸为6.5~10.5 μm×2.0~3.0 μm，分生孢子为球形、近球形，直径2.0~4.5 μm (图1)。根据其形态特征并结合《真菌鉴定手册》^[21]，鉴定为曲霉属。

2.2.2 分子鉴定

经生工测序后，菌株MR-97的ITS序列为532 bp，提交至GenBank获得登录号OK287153.1，将该序列与GenBank数据库中的核酸序列进行相似性比对，与土曲霉Aspergillus terreus(MK952265.1)序列相似性达99.62%。使用MEGA X软件Neighbor-joining法构建该菌株的18S rDNA系统发育树，菌株MR-97与A. terreus聚为一支(图2)。根据菌株形态鉴定及系统发育树结果，菌株MR-97鉴定为土曲霉。

2.3 拮抗真菌对尖孢镰刀菌菌丝生长的影响

在光学显微镜下，正常生长的尖孢镰刀菌菌丝表面光滑，粗细均匀，透明(图3a)；经菌株MR-97作用后的尖孢镰刀菌生长状态见图3b~3d，其菌丝粗细不均，表面粗糙，部分菌丝表现为膨大畸形、干瘪、皱缩、扭曲、折叠等。

2.4 菌株MR-97的抑菌谱

以供试的8种病原真菌为靶标菌，检测菌株MR-97的抑菌谱。结果表明，MR-97的抑菌谱广，对多种病原菌具有不同程度的抑制效果，尤其对恶疫霉的拮抗能力最强，抑菌率为86.29%，其次为对核盘菌、鹅掌楸链格孢、毁灭柱孢菌，抑菌率分别为82.59%、71.48%和68.51%。对细极链格孢、木贼镰刀菌、腐皮镰刀菌和灰葡萄孢的抑菌率分别为67.03%、64.07%、64.81%和64.81%。

2.5 菌株MR-97在土壤中的定殖

经利福平诱导后，待测菌株MR-97经传代培养10代，仍可在含有300 μg/mL利福平的PDA平板稳定生长，标号为MR_Rif-97。土壤定殖试验周期为35 d，未接种标记菌株的供试土壤经检测，其所含微生物无法在含有300 μg/mL利福平的PDA平板生长，由此说明，该质量浓度的抗生素选择培养基可用于MR_Rif-97菌株的有效回收。土壤中菌株MR_Rif-97的含菌量呈现“先降后升再降”趋势。接种7 d时，MR_Rif-97的土壤含菌量为8.9×10⁶ CFU/g；接种后14 d，MR_Rif-97菌株实现扩繁，土壤含菌量上升至峰值，为9.8×10⁶ CFU/g；随后菌株MR_Rif-97的土壤含菌量平缓下降，接种后35 d，仍可达到6.44×10⁶ CFU/g。结果表明，菌株MR-97具有较好的土壤定殖能力。

2.6 菌株MR-97的盆栽防效及促生作用

田间盆栽栽培下，检测菌株MR-97对防风枯萎病的防治效果(表1)，菌株MR-97处理的病情指数为16.25，显著低于对照组的50.59。菌株MR-97与农药多菌灵处理组防效较高，分别为67.86%和68.37%，较施加枯草芽孢杆菌与哈茨木霉粉剂的防效略高。表2显示拮抗菌株MR-97对防风生长的影响，施加MR-97菌液显著增加了防风的全株鲜质量、根鲜质量及根干质量，根干质量达到了每株1.55 g，是CK的3.4倍，促生效果显著。

3 讨论与结论

中药材是农业发展的重要产业之一，目前我国大力支持以中药材为基础的中医药产业协同发展的振兴之路。随着中药材种植业的发展，农药残留问题受到广泛关注^[11]。土壤中微生物资源丰富，是拮抗菌筛选的重要来源。本研究从防风根际土中分离出真菌菌株104株，并从中筛选出1株对尖孢镰刀菌具有较高抑菌效果的菌株MR-97。通过对MR-97菌落、显微形态的观察，及ITS序列分析，鉴定为土曲霉Aspergillus terreus，获得NCBI登录号OK287153.1。

真菌主要通过竞争、寄生、拮抗、促进植物生长及诱导抗病性等多种机制共同作用防治植物病害^[26]。杨志强^[27]从土曲霉ZJ-7中分离出对柑橘青霉菌、大肠埃希菌、溃疡菌、金黄色葡萄球菌具有拮抗作用的多种长链脂肪酸及其衍生物。本研究中发现菌株MR-97可在短期内产生大量孢子与病原菌进行竞争，同时还会使病原菌菌丝出现膨大、菌丝破损、内含物凝集等现象，影响病原菌菌丝的正常生长。有研究表明土曲霉XWC21-10菌株发酵液的4种萃取物对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、假交替单胞菌属SL-1、吉氏库特菌SL-2、金黄色杆菌SL-4等指示菌均有明显的抑制活性；吕恒等^[28]研究发现土曲霉JCL143对黄瓜枯萎病、立枯病、菌核病3种病原菌均具有较强的抑制效果，应用于盆栽研究中，对3种病害的防效均在74%以上。本研究结果表明菌株MR-97具有良好的生防潜力，其分泌的次生代谢物具有广泛的杀菌能力，与前人研究一致，为进一步研究其在田间的应用提供了理论基础。

国内外许多研究表明，生防菌的定殖能力是影响生防效果的重要因素^[29]。因此，生防菌在植物体内和根际土壤中的定殖能力成为评定其是否具有产业化前景的一个重要指标。张屹等^[30]采用绿色荧光标记棘孢木霉M45a浸种，发现其能有效定殖于水稻根系组织，与清水对照相比，M45a 浸种处理的水稻在生长50 d 时其株高、地上部干质量、根际土壤总氮和硝态氮含量显著增加，分别增加8.1%、10.0%、14.92%和22.34%。本研究结果表明土曲霉MR-97在土壤中具有良好的定殖能力，土壤含菌量最高为9.8×10⁶ CFU/g，定殖35 d后，土壤含菌量为64.4×10⁶ CFU/g。对防风枯萎病具有较强的防治效果，防效为67.86%；同时还能显著促进防风生物量的增加，具有良好的促生效果。

本研究通过对防风根际土壤进行分离、筛选，鉴定出1株对防风枯萎病菌具有较强抑制作用，抑菌谱广，且能促进防风植株生长的土曲霉菌株MR-97 ，具有极好的研究价值和生防应用潜力，为下一步的相关研究和生产应用工作的开展奠定了基础。